00000 н. 00005 00000 н. 00005 00000 н. 00005

00000 н. 00005

00000 н. 00005 00000 н. 00005

Промышленные пивоваренные дрожжи, разработанные для производства первичных детерминант вкуса в охмеленном пиве

Клонирование

Все штаммы, плазмиды экспрессии и дополнительные плазмиды, используемые для конструирования штаммов перечислены и описаны в дополнительных таблицах 6–13.Файлы последовательностей, соответствующие каждой плазмиде, можно найти в публичном реестре JBEI (https://public-registry.jbei.org/) ³¹ . Плазмиды размножали в штамме Dh20B Escherichia coli и очищали с помощью Miniprep (Qiagen, Germantown, MD, США). Плазмиды «пути», использованные для создания сконструированных пивоваренных штаммов, были собраны стандартным методом Golden Gate с использованием рестрикционных ферментов типа II и ДНК-лигазы Т7 (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) ^24,32 (для дополнительной информации, см. схематическую стратегию сборки на дополнительном рис.3). Все другие плазмиды, полученные в этом исследовании, были сконструированы сборкой Гибсона ³³ с использованием мастер-микса сборки Гибсона (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США). Конструкции были разработаны с использованием программного обеспечения DeviceEditor bioCAD ³⁴ , а сборочные праймеры были созданы с помощью программного обеспечения для автоматизации конструирования сборки ДНК j5 ³⁵ с использованием настроек по умолчанию. ПЦР-амплификацию проводили с использованием ДНК-полимеразы PrimeSTAR GXL в соответствии с инструкциями производителя (Takara Bio, Mountain View, CA, USA).Гены, кодирующие полноразмерные линалоол и гераниолсинтазы, были заказаны либо у IDT (Сан-Диего, Калифорния, США) в виде G-блоков, либо у Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США) в виде цепочек ДНК. Кодирующие последовательности гетерологичных генов во всех плазмидах были подтверждены секвенированием по Сэнгеру (Genewiz, Саут-Плейнфилд, Нью-Джерси, США и Quintara, Южный Сан-Франциско, Калифорния, США).

Конструкция штамма

Лабораторные штаммы дрожжей трансформировали высокоэффективным методом ацетата лития ³⁶ .Штаммы культивировали в среде дрожжевой экстракт + пептон + декстроза (YPD), если не указано иное. Для отбора трансформантов, содержащих кассеты ауксотрофной комплементации, трансформированные клетки высевали на стандартную среду для выпадения (Sunrise Science Products, Сан-Диего, Калифорния, США). Для отбора трансформантов, содержащих кассеты устойчивости к лекарствам, клетки выделяли в среде YPD в течение 4 ч после трансформации, а затем высевали на среду YPD с добавлением 200 мкг / л генетицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) или гигромицина B. (Сигма-Олдрич, Св.Луис, Миссури, США). Незначительные изменения были внесены в условия культивирования для трансформации пивных дрожжей: культуры перед трансформацией выращивали в среде YPD с добавлением 200 мг / л сульфата аденина при 20 ° C в стеклянных пробирках со встряхиванием при 200 об / мин. Одну колонию использовали для инокуляции исходной 5 мл культуры, которую выращивали в течение ночи до помутнения. Эту культуру использовали для инокуляции второй культуры объемом 5 мл до OD ₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм) 0,01, которую выращивали в течение 18 часов.Затем вторую культуру использовали для инокуляции культур объемом 50 мл в колбах Эрленмейера на 250 мл до OD ₆₀₀ 0,05. После ~ 8 часов роста штаммы трансформировали методом ацетата лития ³⁶ , клетки выделяли в среде YPD в течение 4 часов, высевали на YPD с добавлением 200 мкг / л генетицина, а затем выращивали в течение 5-7 дней при 20 ° C. ° C.

, использованная для геномной интеграции, была получена либо с помощью ПЦР-амплификации плазмидной ДНК, либо путем переваривания плазмиды рестрикционными ферментами. Для конструирования штамма, гипер-продуцирующего GPP, интеграционные фрагменты амплифицировали из соответствующих плазмид с помощью ПЦР (дополнительная таблица 7).Для конструирования пивоваренных штаммов, интегрированных в путь, плазмидную ДНК линеаризовали рестрикционным расщеплением с Not I-HF и Pst I-HF (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) (дополнительные таблицы 10 и 11).

Все события интеграции были подтверждены диагностической ПЦР с использованием GoTaq Green Master Mix (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Для штаммов пивных дрожжей гомозиготность в локусе интеграции тестировали с использованием праймеров, нацеленных на 5 ‘и 3’ соединения желаемого аллеля и родительского аллеля.Идентичность мультигенной интеграции проверяли с помощью праймеров, нацеленных на каждое из четырех сочленений промотор / ген. Идентификационные данные промоторов, соответствующие каждому штамму, можно найти в дополнительных таблицах 12 и 13.

Скрининг синтаз

Для скрининга линалоола и гераниолсинтазы отдельные колонии отбирали из планшета для трансформации и использовали для инокуляции культур в 5 мл CSM-Leu. (Sunrise) + 2% рафинозы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) среда. Через 24 ч прекультуры разбавляли свежим CSM-Leu + 2% галактозы (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) среду до OD 0,05 и выращивали в течение 72 ч при встряхивании при 200 об / мин. Через 24 часа после инокуляции добавляли органический слой для улавливания гидрофобных монотерпенов. Декан использовали в качестве верхнего слоя для культур, экспрессирующих LIS, а додекан использовали для культур, экспрессирующих GES. Наложение было выбрано таким образом, чтобы минимизировать перекрытие времен удерживания между растворителем и продуктом для последующего анализа методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ / МС).

Микроаэробная ферментация

Штаммы наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C.Отдельные колонии использовали для инокуляции исходных 2 мл прекультур в 24-луночные планшеты (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), которые выращивали в течение 3 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Штаммы выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л солодового экстракта (ME) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Каждая лунка содержала стеклянный шарик 5 мм (Chemglass Life Sciences, Вайнленд, Нью-Джерси, США). Полученные культуры использовали для инокуляции вторых 6 мл предварительных культур в свежие 24-луночные планшеты до OD 0,1, которые затем выращивали в течение 3 дней при 20 ° C со встряхиванием при 120 об / мин.Затем полученные культуры использовали для инокуляции 25 мл культур в стеклянных пробирках до OD 1,0. Эти культуры были оснащены односторонним воздушным шлюзом для микроаэробной ферментации и выращивались в течение 5 дней при 20 ° C (дополнительный рисунок 5). Пробирки встряхивали в течение 30 с каждые 24 ч.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

мальтотриозу, мальтозу, глюкозу и этанол были разделены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и детектируется детектором показателя преломления (RI).На 5 день образцы ферментации центрифугировали при 18000 × g в течение 5 минут, фильтровали с использованием фильтров для центрифужных пробирок Costar ^® Spin-X ^® , поры 0,22 мкм, переносили в пробирки для ВЭЖХ и загружали в Agilent 1100. ВЭЖХ с автоматическим пробоотборником Agilent серии 1200, ионообменной колонкой Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) и детектором Agilent серии 1200 RI. Метаболиты разделяли с использованием 4 мМ водного раствора H ₂ SO ₄ с расходом 0.6 мл / мин при 50 ° C. Абсолютные концентрации образцов рассчитывались с использованием линейной модели, построенной на основе стандартной кривой, состоящей из аутентичных стандартов мальтотриозы, мальтозы, глюкозы и этанола (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), разведенных в воде в диапазоне 0,2–20 г. / L. Все данные представлены в дополнительной таблице 15.

Количественное определение монотерпенов

Монотерпены были определены количественно с помощью анализа ГХ / МС с использованием системы ГХ / МС Agilent серии 6890 с масс-селективным детектором 5973.Во всех экспериментах вводили 1 мкл образца (без разделения) с использованием He в качестве газа-носителя в колонку CycloSil-B (Agilent, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, кат. 112-6632). Газ-носитель поддерживали при постоянной скорости потока 1,0 мл / мин, а режим EMV был установлен на коэффициент усиления 1.

Отбор проб, температурный режим печи и мониторинг ионов были оптимизированы для каждого эксперимента: для количественного определения производства линалоола и гераниола. в ситах для терпен-синтазы образцы центрифугировали и собирали органическую фазу (наложенный растворитель), разбавленную 1:10 этилацетатом (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), переносили в стеклянный флакон для ГХ и вводили в колонку для ГХ. Для образцов, соответствующих экрану LIS, температуру печи поддерживали на уровне 50 ° C в течение 12 мин, после чего следовало повышение со скоростью 10 ° C / мин до температуры 190 ° C и повышение со скоростью 50 ° C / мин до конечного значения. температуре 250 ° C, а затем выдерживали при 250 ° C в течение 1 мин. Задержка растворителя была установлена ​​на 20 мин, и МС был установлен в режим SIM для сбора данных, мониторинга m / z ионов 80, 93 и 121. Для образцов, соответствующих экрану гераниолсинтазы, поддерживалась температура печи. при 50 ° C в течение 5 минут, затем с линейным изменением со скоростью 30 ° C / мин до температуры 135 ° C, затем с линейным изменением со скоростью 5 ° C / мин до температуры 145 ° C, затем с линейным изменением со скоростью 30 ° C / мин до температуре 250 ° C и выдерживали при 250 ° C в течение 1 мин.Задержка растворителя была установлена ​​на 10,8 мин, а МС был настроен на мониторинг m / z ионов 69, 93, 111 и 123. Для количественного определения линалоола и гераниола в микроаэробных ферментациях, проводимых с пивными дрожжами, образцы были извлечены в день. 5 с использованием этилацетата. Образцы ферментации собирали и центрифугировали, 1600 мкл супернатанта смешивали с этилацетатом в соотношении 4: 1 в 96-луночном планшете, планшет герметично закрывали и встряхивали в течение 2 минут, затем центрифугировали при 3000 × г для 5 мин и 30 мкл этилацетата переносили в стеклянный сосуд для ГХ.Полученный препарат вводили в колонку для ГХ. Для количественного определения линалоола и гераниола в различных коммерческих сортах пива 2 мл этилацетата добавляли к 8 мл пива в стеклянных пробирках (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Его перемешивали вручную в течение 2 минут и центрифугировали при 1000 × г в течение 10 минут. Тридцать микролитров этилацетатного слоя переносили в стеклянные сосуды для ГХ, и полученный препарат вводили в колонку для ГХ. Как для экспериментов по микроаэробной ферментации, так и для отбора проб коммерческого пива температуру печи поддерживали на уровне 50 ° C в течение 5 минут, после чего следовало повышение со скоростью 5 ° C / мин до температуры 200 ° C и повышение на 50 ° C / мин до конечной температуры 250 ° C, а затем выдерживают при 250 ° C в течение 1 мин.Задержка растворителя была установлена ​​на 5 минут, а МС был настроен на мониторинг m / z ионов 55, 69, 71, 80, 81, 93, 95, 107, 121, 123 и 136.

Площади пиков линалоол и гераниол определяли количественно с использованием программного обеспечения MSD Productivity ChemStation (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Абсолютные концентрации образцов рассчитывали с использованием линейной модели, построенной на основе стандартной кривой, составленной для подлинных стандартов линалоола и гераниола (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).Для экспериментов по скринингу монотерпенсинтазы стандарты разбавляли этилацетатом в диапазоне 0,2–50 мг / л. Для экспериментов по микроаэробной ферментации и отбора проб коммерческого пива стандарты добавляли к препарату, экстрагированному из образца ферментации родительского штамма (т. Е. Контрольному препарату, используемому для обеспечения точного базового сигнала) в диапазоне 0,2–10 мг / л. При расчете фактических концентраций кажущиеся концентрации были масштабированы на основе разбавления или концентрации в препарате для инъекции ГХ.

Proteomics

Данные о содержании белка представлены в дополнительной таблице 16. Образцы культуры (5 мл) отбирали через 2 дня, встряхивали и центрифугировали при 3000 × г в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали, а осадок мгновенно замораживали. Осадки клеток на планшетах лизировали осаждением хлороформ-метанол, как описано ниже, в то время как образцы в пробирках лизировали путем повторного суспендирования осадка в 600 мкл буфера для лизиса дрожжей (6 М мочевина в 500 мМ бикарбоната аммония) с последующим взбиванием шариков. с шариками из диоксида циркония / диоксида кремния 500 мкл (0.Диаметр 5 мм; BioSpec Products, Бартлсвилл, Оклахома, США). Образцы в пробирках подвергали взбиванию шариками в течение пяти циклов по 1 мин с 30 с на льду между каждым циклом. Затем их центрифугировали в настольной центрифуге на максимальной скорости в течение 2 мин для осаждения обломков клеток, а прозрачный лизат переносили в свежие пробирки. Лизис клеток на планшетах и ​​осаждение белков достигали с использованием экстракции хлороформ-метанол ³⁷ . Осадки ресуспендировали в 60 мкл метанола и 100 мкл хлороформа, а затем в 50 мкл гранул диоксида циркония / диоксида кремния (0.Диаметр 5 мм; BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA) добавляли в каждую лунку. Планшет подвергали ударным нагрузкам в течение пяти циклов по 1 мин с 30 с на льду между циклами. Супернатанты переносили в новый планшет и добавляли 30 мкл воды в каждую лунку. Планшет центрифугировали 10 мин при максимальной скорости, чтобы вызвать разделение фаз. Слои метанола и воды удаляли, а затем в каждую лунку добавляли 60 мкл метанола. Планшет центрифугировали еще 10 мин при максимальной скорости, затем слои хлороформа и метанола удаляли и осадки белка сушили при комнатной температуре в течение 30 мин перед повторным суспендированием в 100 мМ бикарбонате аммония с 20% метанолом.

Концентрацию белка в образцах измеряли с помощью набора DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Всего 50 мкг белка из каждого образца переваривали трипсином для целевого протеомного анализа. Образцы белка восстанавливали путем добавления трис 2- (карбоксиэтил) фосфина до конечной концентрации 5 мМ с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. Йодацетамид добавляли до конечной концентрации 10 мМ для алкилирования образцов белка, а затем инкубировали в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.Трипсин добавляли в соотношении трипсин: общий белок 1:50, и образцы инкубировали в течение ночи при 37 ° C.

Пептиды анализировали с использованием системы жидкостной хроматографии Agilent 1290, соединенной с масс-спектрометром Agilent 6460 QQQ (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Образцы пептида (10–20 мкг [LC2]) разделяли на колонке Ascentis Express Peptide ES-C18 (размер частиц 2,7 мкм, размер пор 160 Å, длина 5 см × внутренний диаметр 2,1 мм, соединенный с колонкой 5 мм × 2,1 мм. id защитная колонка с аналогичным размером частиц и пор; Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Миссури, США), при этом система работала со скоростью потока 0,400 мл / мин и отсеком колонки при 60 ° C. Пептиды элюировали в масс-спектрометр через градиент с начальными исходными условиями 95% буфера A (0,1% муравьиной кислоты) и 5% буфера B (99,9% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты). Буфер B поддерживали на уровне 5% в течение 1,5 мин, а затем увеличивали до 35% буфера B в течение 3,5 мин. Буфер B был дополнительно увеличен до 80% за 0,5 мин, где он выдерживался в течение 1 минуты, а затем снова снизился до 5% буфера B за 0.3 мин, где ее выдерживали в течение 0,2 мин для повторного уравновешивания колонки до начального начального состояния. Пептиды были ионизированы источником Agilent Jet Stream ESI, работающим в режиме положительных ионов со следующими параметрами источника: температура газа = 250 ° C, поток газа = 13 л / мин, давление распылителя = 35 фунтов на квадратный дюйм, температура газа в оболочке = 250 ° C, поток газа через оболочку = 11 л / мин, VCap = 3500 В. Данные были получены с помощью Agilent MassHunter, версия B.08.00. Полученные файлы данных были обработаны с использованием Skyline ³⁸ версии 3.6 (MacCoss Lab, Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США), а количественная оценка пиков была уточнена с помощью mProphet ³⁹ в Skyline.

Анализ данных

Анализ данных проводился с использованием языка статистического программирования R ⁴⁰ . Для визуализации данных использовались дополнительные библиотеки ^{41,42,43,44,45} . Для тепловых карт анализа белков и метаболитов (рис. 2e и дополнительный рис. 9) относительные уровни были представлены следующим образом: силы промоторов были представлены в виде доли от их ранее сообщенного рангового порядка ²⁴ в диапазоне от P _RNR2 (0 ) до П _ТДх4 (1).\ prime = \ frac {{s_i — {\ mathrm {min}} (S)}} {{{\ mathrm {max}} (S) — {\ mathrm {min}} (S)}} $$

(1)

Для анализа сахара неферментированный МЭ был включен в расчет макс / мин. Для сбраживаемых сахаров (т.е. мальтотриозы, мальтозы, глюкозы) масштабированные значения вычитали из 1, чтобы представить близость к желаемому профилю потребления сахара.

Метрика расстояния сконструированного штамма по отношению к данному коммерческому пиву была рассчитана с использованием манхэттенской длины как расстояния между производством монотерпена и концентрацией монотерпена в пиве, а также расстояния между потреблением сахара и родительским штаммом.Сначала для каждого вида, линалоола и гераниола, рассчитывалась разница между log ₁₀ -преобразованными значениями концентрации монотерпена сконструированного штамма и целевой концентрацией монотерпена в пиве. Во-вторых, были рассчитаны абсолютные значения этих разностей. Наконец, полученные значения вместе с долей общего сахара, оставшейся после ферментации, усредняли.

Математическое моделирование

На Python были построены три разные модели для прогнозирования продукции монотерпена на основе уровней белка (подробное описание и реализацию см. В файле дополнительных данных 1).Файлы, содержащие данные, используемые для создания прогнозных моделей, включены в качестве файлов дополнительных данных 2 и 3. И гауссовский регрессор, и линейные модели были реализованы с использованием Scikit-learn ⁴⁶ . Дополнительные уравнения, необходимые для описания линейной модели, приведены в дополнительной таблице 3. Уравнения, описывающие кинетическую модель Михаэлиса – Ментен, приведены в дополнительной таблице 4, а схема структуры модели представлена ​​на дополнительном рисунке 13. Кинетические параметры были взяты из литература (дополнительная таблица 5) и концентрации белка приведены в дополнительном файле данных 2.Были включены свободные параметры для преобразования относительных количеств белка в абсолютные значения белка. Кроме того, параметр β определял относительное соотношение между эндогенными FPPS и FPPS *.

Модели линейного и гауссовского регрессоров были подобраны с использованием стандартных методов из библиотеки Scikit Learn. Кинетическая модель была построена вручную без внешних библиотек. Чтобы соответствовать кинетической модели, был использован алгоритм дифференциальной эволюции для выполнения оптимизации параметров нелинейной функции стоимости.В частности, сумма квадратов остаточной ошибки прогнозов модели на основе деформаций первой итерации была минимизирована по отношению к ранее описанным параметрам. Кинетические коэффициенты были ограничены, чтобы изменяться на порядок величины от значений, описанных в литературе. Для перекрестной проверки моделей и минимизации переобучения к каждой модели применялась методология исключения по одному. Остаточные погрешности этого метода перекрестной проверки приведены в дополнительной таблице 2.

Анализ, выполненный для прогнозирования степени улучшения характеристик для штаммов второй итерации (рис. 4 и дополнительный рис. 10) по сравнению со случайно созданными штаммами, описан в дополнительном примечании 3.

Анализ токсичности

OD _{600 Было проведено} измерений в 48-луночных прозрачных планшетах с плоским дном (Corning Inc., Корнинг, Нью-Йорк, США) с использованием считывающего устройства Tecan Infinite F200 PRO с регистрацией каждые 15 мин. Анализ проводился с использованием пользовательских скриптов Python.Кривые роста рассчитывали путем усреднения шести биологических повторов; заштрихованные области представляют одно стандартное отклонение от среднего. Скорость роста рассчитывалась со скользящим окном 5 ч, что позволяло найти максимальную скорость роста. Скорость роста представлена ​​как среднее значение шести биологических повторов; планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы (дополнительный рисунок 12).

Пилотные ферментации

Штаммы наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C. Одиночные колонии использовали для инокуляции исходных культур объемом 5 мл в стеклянные пробирки, которые выращивали в течение 2 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин.Полученные культуры использовали для инокуляции 1 л культур в 2-литровых стеклянных колбах Эрленмейера, которые затем выращивали в течение 3 дней при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин. Штаммы выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л ME (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Затем полученные культуры использовали для инокуляции промышленных ферментаций сусла, произведенного на экспериментальной пивоварне объемом 1,76 гл.

Для первой серии ферментаций 35 кг двухрядного солода измельчали ​​и добавляли к 105 л деионизированной воды, обработанной 79.15 г пивоваренных солей. Затирание проводили в течение 30 минут при 65 ° C, 10 минут при 67 ° C и 10 минут при 76 ° C. Суслу давали рециркулировать в течение 10 минут и отделяли фильтрованием. Барботирование происходило в течение 58 минут, давая конечный объем перед кипячением в варочном котле 215 л. Сусло кипятили до тех пор, пока оно не достигло конечного объема 197 л и плотности 11,65 ° Плато. Добавки в чайник включали 125 г гранул хмеля Magnum, 15,1 г питательных веществ для дрожжей Yeastex и 15 г Protofloc (Murphy and Son, Ноттингем, Великобритания).Ингредиенты были получены от Brewers Supply Group (Шакопи, Миннесота, США), если не указано иное. После того, как сусло было отделено от горячего осадка, оно было перенесено в четыре специальных ферментера на 56 л (JVNW, Канби, Орегон, США), каждый из которых был наполнен до 40 л. Пиво ферментировали при 19 ° C до достижения конечной плотности. в течение дополнительных 24 часов для удаления вицинального дикетона (VDK), а затем кондиционировали на холоде при 0 ° C. Продолжительность ферментации и, в свою очередь, продолжительность холодового кондиционирования зависела от штамма.Образцы отбирали каждые 24 часа для измерения ° Плато и pH (см. Дополнительный рисунок 11). Полученное пиво фильтровали под давлением и газировали перед хранением в бочонках емкостью 7,75 галлона. Образцы были собраны во время процесса кегирования для анализа Alcolyzer (Anton Paar, Ashland, VA) (см. Дополнительную таблицу 17).

Для второй серии ферментаций 35 кг двухрядного солода измельчали ​​и добавляли к 105 л деионизированной воды, обработанной 79 г пивоваренных солей. Затирание проводили в течение 30 минут при 65 ° C, 10 минут при 67 ° C и 10 минут при 76 ° C.Суслу давали рециркулировать в течение 10 минут и отделяли фильтрованием. Барботирование происходило в течение 52 минут, давая конечный объем перед кипячением в варочном котле 214 л. Сусло кипятили до тех пор, пока оно не достигло конечного объема 194 л и плотности 11,25 ° Плато. Добавки в чайник включали 97,01 г гранул хмеля Galena, 15,1 г питательных веществ для дрожжей Yeastex и 15 г Protofloc (Murphy and Son, Ноттингем, Соединенное Королевство). Ингредиенты были получены от Brewers Supply Group (Шакопи, Миннесота), если не указано иное.После того, как сусло было отделено от горячего осадка, оно было перенесено в четыре нестандартных ферментера на 56 л (JVNW, Canby, OR), каждый из которых был наполнен до 40 л. Пиво ферментировали при 19 ° C до достижения конечной плотности и выдерживали в течение некоторого времени. дополнительные 24 часа для удаления VDK, а затем холодное кондиционирование при 0 ° C. Продолжительность ферментации и, в свою очередь, продолжительность холодового кондиционирования зависела от штамма. Образцы отбирали каждые 24 часа для измерения ° Плато и pH (см. Дополнительный рисунок 11). Через 48 ч при 0 ° C 88,5 г сухого хмеля Cascade (либо из Вашингтона, либо из Айдахо) добавляли в два ферментера, содержащих родительский штамм WLP001 .Сухой хмель оставляли на пиве при 1,67 ° C на 1 неделю перед фильтрацией. Полученное пиво фильтровали под давлением и газировали перед хранением в бочонках емкостью 7,75 галлона. Образцы были собраны во время процесса кегирования для анализа Alcolyzer (Антон Паар, Ашленд, Вирджиния, США) (см. Дополнительную таблицу 18).

Сенсорный анализ

Одобрение Институционального наблюдательного совета на исследования на людях было получено от Управления по защите человека в Калифорнийском университете в Беркли (номер протокола CPHS 2017-05-9941).Комитет по защите прав человека рассмотрел и одобрил заявку в соответствии с 7-й категорией федеральных нормативных актов.

Эксперты: Органолептический анализ сваренного пива был проведен в Lagunitas Brewing Company (Петалума, Калифорния, США). Первая группа состояла из 27 сотрудников-участников (17 мужчин и 10 женщин), вторая — из 13 сотрудников-участников (11 мужчин и 2 женщины), с опытом от 2 до 154 дегустационных сессий, которые посетили в 2017 календарном году. Возраст от среднего до среднего. От 20 до 50 лет.Все участники прошли базовую сенсорную подготовку в соответствии со стандартами Lagunitas.

Органолептический анализ: Образцы объемом 2 унции были представлены в прозрачных стаканах для бренди на 6 унций (Либби, Толедо, Огайо, США). Каждый член группы получил пять очков, один контроль и четыре образца (один слепой контроль и три переменные), случайным образом расположенных в соответствии со сбалансированной конструкцией блоков. Блок-дизайн и сбор данных были выполнены с использованием программного обеспечения EyeQuestion ^® (Logic8 BV, Нидерланды). За один присест участников попросили оценить интенсивность хмелевого аромата по сравнению с контролем по 9-балльной порядковой шкале, закрепленной на одном конце с отметкой «Нет разницы», а на другом конце — «Крайняя разница».”

Анализ данных: данные были проанализированы с использованием теста Даннета в сочетании с односторонним дисперсионным анализом с использованием EyeOpenR ^® (Logic8 BV, Нидерланды). Анализ проводился с доверительной вероятностью 95%. Слепой контроль используется в качестве эталонной выборки для учета возможной систематической ошибки оценки.

Сухое охмеление для оценки вариации между препаратами хмеля

Родительский штамм WLP001 наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C.Одиночную колонию использовали для инокуляции начальной 50 мл прекультуры в стеклянной колбе Эрленмейера на 250 мл, которую выращивали в течение 1 дня при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Штамм выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л ME (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с добавлением YPD. Полученную культуру использовали для инокуляции предкультуры объемом 1 л в стеклянной колбе Эрленмейера на 2 л, которую затем выращивали в течение 2 дней при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин. Полученную культуру затем использовали для инокуляции четырех 2-литровых культур в 4-литровых стеклянных колбах Эрленмейера, которые затем выращивали в течение 1 дня при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин.Полученные культуры затем использовали для инокуляции 8 л культур в 3-галлонных стеклянных бутылях (Midwest Supplies, Розвилл, Миннесота, США). Эти культуры были оборудованы односторонней воздушной пробкой для микроаэробной ферментации и выращивались в течение 6 дней при 20 ° C. Тем временем пять различных образцов хмеля Cascade, выращенных на фермах на северо-западе Тихого океана, были получены от YCH Hops (Якима, Вашингтон, США). Образцы хмеля измельчали ​​с помощью ступки с пестиком и жидкого азота. На 6 день из ферментации отбирали образцы (в качестве контроля без охмеления), и к каждой ферментации добавляли 25 г хмеля.Хмель оставляли настаиваться на 3 дня, после чего образцы собирали для анализа ГХ / МС.

Вариации от партии к партии

Штаммы наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C. Одиночные колонии использовали для инокуляции исходных 5 мл предварительных культур в стеклянные пробирки, которые выращивали в течение 2 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Штаммы выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л ME (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Полученные культуры использовали для инокуляции 500 мл прекультур в 2-литровых стеклянных колбах Эрленмейера, которые затем выращивали в течение 1 дня при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин.Полученные культуры затем использовали для инокуляции 8 л культур в 3-галлонных стеклянных бутылях (Midwest Supplies, Розвилл, Миннесота, США). Эти культуры были снабжены односторонним воздушным затвором для микроаэробной ферментации и выращивались в течение 12 дней при 20 ° C. Образцы были взяты на 12 день для анализа ГХ / МС.

Доступность данных

Авторы заявляют, что все данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны в документе и дополнительных информационных файлах. Данные о последовательностях и штаммы, полученные в этом исследовании, были депонированы в публичном реестре JBEI.См. Дополнительные таблицы 6–13 для получения информации о последовательностях конструкций и штаммах. Доступ к компьютерному коду, используемому в этом исследовании, можно получить из дополнительных данных 1.

Конструирование фабрик по производству микробных клеток для производства растительных натуральных продуктов: от принципов проектирования до производства в промышленных масштабах | Microbial Cell Factories

Границы | Метаболическая инженерия микроорганизмов для производства флавоноидов

Введение

Флавоноиды — это особый класс встречающихся в природе вторичных метаболитов, которые синтезируются растениями (Pandey et al., 2016) и гриб (Correa et al., 2011). Химически все флавоноиды обладают общей структурой 15-углеродного скелета с двумя фенильными кольцами (кольца A и B), соединенными гетероциклическим кольцом (кольцо C). В путях биосинтеза флавоноидов кольцо А образуется из малонил-КоА, а кольцо В образуется из 4-кумароил-КоА, который синтезируется из фенилаланина через путь шикимата (Averesch and Krömer, 2018). В зависимости от химической структуры флавоноиды можно разделить на несколько различных подкатегорий, таких как халконы, флаваноны, флавоны, изофлавоны, флавонолы, флаванонолы, флаванолы и антоцианы (Tohge et al., 2017) (рисунок 1).

Рисунок 1. Молекулярные структуры различных подклассов флавоноидов. Основа каждого подкласса окрашена в синий цвет.

Флавоноиды выполняют многие важные функции в растениях, такие как формирование пигментации для окраски цветов (Nakayama et al., 2000), симбиотическая фиксация азота (Fox et al., 2001) и защита от ультрафиолета (Kootstra, 1994). Кроме того, флавоноиды демонстрируют значительное физиологическое и биохимическое воздействие на млекопитающих из-за их уникальной химической структуры.Большинство флавоноидов обладают сильной антиоксидантной (Naderi et al., 2003), противовоспалительной (Kim et al., 2004), антибактериальной (Cushnie and Lamb, 2011) и противоопухолевой активностью (Ravishankar et al., 2013); таким образом, они широко используются в пищевой, нутрицевтической и фармацевтической промышленности (Kay et al., 2012; Georgiev et al., 2014; Hajimehdipoor et al., 2014). Например, апигенин можно использовать для лечения метаболического синдрома, вызванного диетой с высоким содержанием жиров и фруктозы, путем снижения уровней лептина и повышения уровней адипонектина (Zhang et al., 2018). Галлат эпигаллокатехина и нарингенин способны поддерживать баланс липидов и жиров в крови (Zhang et al., 2018). Кверцетин, генистеин и нарингенин оказывают значительное влияние на снижение уровней экспрессии провоспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли α и интерлейкина 6 (Zhang et al., 2018). Благодаря их значительной биоактивности мировой рынок флавоноидов быстро растет и, как ожидается, достигнет 1,05 миллиарда долларов в 2021 году (Shah et al., 2019).

В настоящее время производство флавоноидов в основном зависит от экстракции растений, которая ограничивается трудностями в доступе и поставке сырья, низкой распространенности и доступности в растениях, а также низким выходом продукта (Jiang et al., 2005; Pyne et al., 2019). Химические методы производства флавоноидов также не являются предпочтительными из-за сложных процессов, строгих условий реакции и плохой селективности (Pyne et al., 2019). В качестве альтернативы введение естественных путей биосинтеза флавоноидов из растений в микробных хозяев с помощью синтетической биологии и стратегий метаболической инженерии представляет собой возможный подход к производству флавоноидов. В 2003 году впервые было сообщено о микробном синтезе флавоноидов; с тех пор в микроорганизмах были успешно сконструированы различные пути биосинтеза флавоноидов (Hwang et al., 2003). В последнее время в строительстве фабрик микробных клеток для эффективного производства флавоноидов был достигнут большой прогресс (Pei et al., 2020; Wang et al., 2020; Yang et al., 2020). В этой статье мы резюмируем недавние и заметные достижения в области метаболической инженерии и синтетической биологии в направлении синтеза флавоноидов с соответствующими примерами случаев (таблица 1). Представлены эффекты для создания искусственных путей биосинтеза флавоноидов в микробах и для оптимизации титра продуктов, выхода и продуктивности.

Таблица 1. Метаболическая инженерия продукции флавоноидов в микроорганизмах.

Метаболическая инженерия микроорганизмов для производства флавоноидов

Путь биосинтеза флавоноидов у растений был четко проиллюстрирован, который простирается от пути шикимата (Falcone Ferreyra et al., 2012) (Рис. 2). По этому пути нативные предшественники фенилаланин и тирозин превращаются в p -кумароил-КоА. Затем одна молекула p -кумароил-КоА и три молекулы малонил-КоА превращаются в нарингенин халкон посредством циклизации Клайзена под действием халконсинтазы (ХС).Последовательно халкон нарингенина автоматически превращается в нарингенин или катализируется изомеразой халкона (CHI). Образующийся нарингенин на этом пути служит важным промежуточным звеном для синтеза других классов флавоноидов. Например, флавоны образуются в результате экспрессии флавон-синтазы (FNS). Изофлавоноиды образуются путем введения изофлавон-синтазы (IFS). Совместная экспрессия флавоноид-3-гидроксилазы (F3H) и флавонолсинтазы (FLS) приводит к образованию флавонолов, тогда как флаванолы могут быть получены путем совместной экспрессии F3H, дигидрофлавонол-4-редуктазы (DFR) и лейкоантоцианидинредуктазы (LAR) и дальнейшего введения антоцианида (синтазина). ANS) в этот путь может генерировать антоцианы.В последние годы с развитием метаболической инженерии и синтетической биологии все больше и больше флавоноидов получают биосинтез (Shah et al., 2019; Nabavi et al., 2020).

Рисунок 2. Биосинтетические пути флавоноидов в растениях. TAL, тирозин-аммиаклиаза; PAL, фенилаланинаммиаклиаза; C4H, циннамат-4-гидроксилаза; CPR, редуктаза цитохрома P450; 4CL, 4-кумароил-КоА лигаза; АСС, ацетил-КоА карбоксилаза; CHS, халкон-синтаза; CHI, халконизомераза; ФНС, флавон-синтаза; IFS, изофлавон-синтаза; F3H, флаванон-3β-гидроксилаза; FLS, флавонолсинтаза; DFR, дигидрофлавонолредуктаза; LAR, лейкоантоцианидин редуктаза; ANS, антоцианидинсинтаза.Сплошные линии указывают на один шаг, а пунктирные линии — на несколько шагов.

Флаваноны

Флаваноны, включая нарингенин, пиноцембрин и эриодиктиол, являются первыми флавоноидными продуктами в пути биосинтеза флавоноидов. Обычно они присутствуют в цитрусовых, таких как грейпфрут (Peterson et al., 2006), апельсины (Khan et al., 2010) и лимоны (Peterson et al., 2006), и обладают противовоспалительным действием (Bano et al. , 2013), антиоксидант (Miranda et al., 2000), противоопухолевый (Ketabforoosh et al., 2014) и другие важные фармакологические мероприятия. Основным скелетом флаванонов является 2-фенилхромоген, для которого характерно насыщение двойной связи C2 – C3. Структура флаванонов очень активна, и ее можно модифицировать гидроксилированием (Britsch and Grisebach, 1986), метилированием (Koirala et al., 2016) и гликозилированием (Di Majo et al., 2005). Биосинтез нарингенина из предшественника p -кумариновой кислоты был достигнут в Corynebacterium glutamicum за счет сверхэкспрессии CHS и CHI из Petunia hybrida .Нарушая конкурирующие пути, в сконструированных штаммах-хозяевах продуцировалось 35 мг / л нарингенина (Kallscheuer et al., 2016). Считалось, что низкие титры ограничены низкой ферментативной активностью CHS. В качестве альтернативы, Gao et al. (2019) представили SmCHS2 из Silybum marianum в Saccharomyces cerevisiae и получили 648,63 мг / л нарингенина путем экзогенного кормления кумаровой кислотой p .

De novo также был достигнут биосинтез флаванонов из простых источников углерода.Santos et al. представили гены RgTAL (кодирующие тирозин-аммиаклиазу) из Rhodotorula glutinosa , Pc4CL (кодирующие лигазу 4-кумаровую кислоту-КоА) из Petroselinum crispum , PhCHS из P. hybrida и Ms из Medicago sativa в штамм S. cerevisiae с избыточным продуцированием тирозина, что привело к получению 29 мг / л нарингенина с использованием глюкозы в качестве субстрата (Santos et al., 2011). В другом примере путь биосинтеза нарингенина в Arabidopsis thaliana , содержащий фенилаланин аммиаклиазу (PAL), циннамат-4-гидроксилазу (C4H), цитохром P450 редуктазу (CPR), 4CL , CHS и CHI, был перенесен в С.cerevisiae . Исходный рекомбинантный штамм-хозяин генерировал только 1,4 мг / л нарингенина из глюкозы. Для дальнейшего улучшения титра эффект подавления обратной связи был устранен путем делеции ARO3 и введения мутанта ARO4 ^{G 226 S} . В результате продукция нарингенина увеличилась до 2,8 мг / л. Более того, нарушение конкурирующего пути и усиление снабжения предшественником p -coumaric acid позволило штамму хозяина продуцировать 54.5 мг / л нарингенина в экспериментах с встряхиваемыми колбами (Koopman et al., 2012). Недостаточная поставка прекурсора по-прежнему является доминирующим фактором, ограничивающим скорость производства нарингенина на высоком уровне.

Малонил-КоА не только служит важным предшественником для производства флаванонов, но также является важным промежуточным продуктом для синтеза жирных кислот, поддерживающих рост клеток в микроорганизмах (Takamura and Nomura, 1988). Таким образом, существует компромиссное соотношение между биосинтезом флаванона и ростом клеток.Чтобы сбалансировать производственную фазу и фазу роста, Леонард и др. (2008) сконструировали путь ассимиляции малоната в рекомбинантном нарингенин-продуцирующем штамме Escherichia coli путем сверхэкспрессии малонатсинтазы (MatB) и белка-носителя малоната (MatC), выделенных из Rhizobium trifolii . Введение пути ассимиляции малоната позволяет сконструированному штамму E. coli синтезировать малонил-КоА путем экзогенного питания малонатом. Наконец, рекомбинантный E.coli продуцировал 155 мг / л нарингенина, что указывает на 2,7-кратное улучшение титра по сравнению с родительским штаммом без сверхэкспрессии пути ассимиляции малоната (Leonard et al., 2008). Церуленин представляет собой ингибитор синтазы жирных кислот для подавления уровней экспрессии fabB и fabF . Согласно отчету, добавление 200 мкМ церуленина может увеличить концентрацию малонил-КоА с 2 пмоль / мг сухого веса клеток (CDW) до 105 пмоль / мг CDW за 1,5 часа (van Summeren-Wesenhagen and Marienhagen, 2015).За счет экзогенного добавления церуленина в культуры титр нарингенина увеличивался с 29 мг / л до 84 мг / л в сконструированных штаммах-хозяевах (Santos et al., 2011). Хотя эти стратегии могут эффективно повышать уровень малонил-КоА в сконструированном штамме-хозяине, тем самым увеличивая титр флаванонов, высокая стоимость малоната и церуленина ограничивает их использование в производстве флаванонов на высоком уровне. У микробов малонил-КоА образуется из ацетил-КоА, катализируемого комплексом ацетил-КоА-карбоксилазы (АСС).Леонард и др. (2007) представили ACC из Pseudomonas luminescens в E. coli ; титр пиноцембрина достиг 196 мг / л, демонстрируя увеличение титра в 5,8 раза по сравнению с таковым в контрольных штаммах. Кроме того, доступность малонил-КоА также может быть улучшена за счет использования кластерной системы интерференции коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPRi) для подавления уровня экспрессии генов, участвующих в основных метаболических путях. Например, Wu et al.(2015) использовали систему CRISPRi для подавления уровня экспрессии генов fabF , fumC , fabB , suC и adhE в рекомбинантной E. coli , чтобы перенаправить поток углерода в направлении малониловой кислоты. -Синтез CoA. Полученный штамм генерировал 421,6 мг / л нарингенина из тирозина, что является самым высоким показателем продуцирования нарингенина, о котором сообщалось до сих пор (Wu et al., 2015). Недавно Лю и соавт. (2017) пытались улучшить титр нарингенина в S.cerevisiae путем разделения пути биосинтеза нарингенина на три модуля: первый модуль, содержащий TAL, 4CL, CHS и CHI, применялся для биосинтеза нарингенина. Второй модуль, несущий ацетил-КоА-синтазу, АТФ-цитратлиазу и АСС, использовали для накопления малонил-КоА, тогда как третий модуль, несущий мутант ARO4 ^{K 229 L} , использовали для производства большего количества тирозина. Конструирование и интеграция этих трех модулей в конечный штамм привели к получению 90 мг / л нарингенина из глюкозы (Lyu et al., 2017). В другом примере был применен итеративный высокопроизводительный метод скрининга для точной настройки уровня экспрессии генов биосинтетического пути нарингенина. Была сконструирована библиотека промоторов, содержащая серию конститутивных промоторов с разной силой. Эти промоторы случайным образом помещали перед генами пути биосинтеза нарингенина. После нескольких раундов высокопроизводительного скрининга лучший рекомбинантный штамм E. coli продуцировал 191,9 мг / л нарингенина, что представляет собой двукратное увеличение титра по сравнению с титром в штамме, оптимизированном с использованием традиционной стратегии модульной оптимизации (Zhou et al. ., 2019).

На основе пути биосинтеза нарингенина эриодиктиол может быть получен путем введения F3’H в этот путь. 4-гидроксифенилацетат-3-гидроксилаза (EcHpaBC) была идентифицирована и охарактеризована из E. coli . Он способен напрямую преобразовывать нарингенин в эриодиктиол с продуцированием 62,7 мг / л эриодиктиола (Jones et al., 2016a). В другом примере цитохром P450 F3’H, выделенный из Gerbera hybrida , функционально экспрессировался в S.cerevisiae , в результате чего из нарингенина образуется эриодиктиол 200 мг / л (Amor et al., 2010). Кроме того, при прямом введении кофейной кислоты, а не p -кумаровой кислоты в качестве предшественника, эриодиктиол также может быть биосинтезирован посредством сверхэкспрессии 4CL, CHS и CHI. Fowler et al. (2009) представили 4CL, CHS и CHI в E. coli ; 114 мг / л эриодиктиола получали путем экзогенного добавления кофеиновой кислоты в культуры. De novo Биосинтез эриодиктиола из простого источника углерода в E.coli также была получена путем коэкспрессии TAL, 4CL, CHS и CHI с цитохромом P450 F3’H. В этом исследовании слитый белок (tF3’H-tCPR) был создан путем слияния усеченного F3’H с усеченным CPR для улучшения растворимости и ферментативной активности F3’H. Наконец, только 5,7 мг / л эриодиктиола было получено с использованием глюкозы в качестве субстрата (Zhu et al., 2014). Низкая каталитическая эффективность F3’H все еще является фактором, ограничивающим скорость этого пути. Считается, что по сравнению с дрожжами бактериальным хозяевам обычно трудно экспрессировать ферменты цитохрома P450, потому что они неспособны выполнять посттрансляционные модификации и экспрессию мембранных белков.При переносе пути биосинтеза эриодиктиола de novo в S. cerevisiae титр эриодиктиола улучшился до 152 мг / л по сравнению с глюкозой (Eichenberger et al., 2018).

Флавоны

Структурно флавоны соответствуют подгруппе флавоноидов, которая характеризуется 2-фенилхромоген-4-оновой основной цепью и имеет двойную связь между C2 и C3. Флавоны обычно содержатся во фруктах и ​​овощах, таких как морковь, петрушка, мята, красный перец и перец чили (Panche et al., 2016) и обладают огромными преимуществами для здоровья, такими как противовоспалительное (Huang and Ho, 2010), противоопухолевое (Li-Weber, 2009), антиоксидантное (Škerget et al., 2005), гипогликемическое и гиполипидемическое действие (Sharma et al. , 2008) и профилактике сердечных заболеваний (Hirvonen et al., 2001). Апигенин, обычный флавон, может быть синтезирован из нарингенина, катализируемого ФНС. Первый случай биосинтеза апигенина в микроорганизмах был зарегистрирован в 2006 году. Leonard et al. (2006) представили 4CL, CHS, CHI и FNS от P.crispum в E. coli ; 415 мкг / л апигенина было произведено из p -кумаровой кислоты, а степень превращения составила всего 2,9% (Леонард и др., 2006). С тех пор сообщалось о непрерывных исследованиях по улучшению производства апигенина. Ли и др. (2015) сконструировали путь биосинтеза апигенина в E. coli , состоящий из 4CL из Oryza sativa , CHS из Populus euramericana , CHI из Medicago truncatula и FNS из Parsley в E.coli , 23 мг / л апигенина получали из p -кумаровой кислоты. Затем титр был дополнительно увеличен до 30 мг / л за счет повышения уровней экспрессии 4CL и CHS (Lee et al., 2015). Гидроксилирование апигенина в положении 3 ‘приводит к лютеолину. Эта реакция обычно катализируется F3’H. Недавно Marin et al. сконструировали путь биосинтеза лютеолина de novo в Streptomyces albus , используя F3’H из A. thaliana , и сгенерировали 0.09 мг / л лютеолина (Marín et al., 2017). Совсем недавно байкалеин (5,6,7-тригидроксифлавон) и скутеллареин (4 ‘, 5,6,7-тетрагидроксифлавон) также были синтезированы в E. coli . Сверхэкспрессия PAL из Rhodotorula toruloides , 4CL и FNS из P. crispum , CHS из P. hybrida , CHI из M. sativa , F6’H (кодирующего флавоноид 6′-гидроксилазу) из Scutellaria baicalensis и CPR из A. thaliana , байкалеин и скутеллареин могут быть получены из тирозина и фенилаланина соответственно (рис. 3).Чтобы удалить стадию ограничения скорости, гидрофильная модификация 2B1 была включена с N-концевым усеченным F6’H, чтобы увеличить его растворимость в E. coli , в результате чего во встряхиваемой колбе было получено 8,5 мг / л байкалеина и 47,1 мг / л скутеллареина. эксперименты. Дальнейшее повышение доступности малонил-КоА значительно улучшило титры до 23,6 мг / л байкалеина и 106,5 мг / л скутеллареина (Li et al., 2019).

Рис. 3. Микробное производство скутелларина в E. coli . (A) Биосинтез скутелларина из фенилаланина; (B) Биосинтез скутелларина из апигенина. PAL, фенилаланинаммиаклиаза; C4H, циннамат-4-гидроксилаза; 4CL, 4-кумароил-КоА лигаза; CHS, халкон-синтаза; CHI, халконизомераза; FNSII, флавон-синтаза II; F6H, флавон-6-гидроксилаза; F7GAT, флавоноид-7-O -глюкуронозилтрансфераза; UDPGDH, UDP-глюкозодегидрогеназа. Сплошные линии указывают на один шаг, а пунктирные линии — на несколько шагов.

За исключением гидроксилирования, другие модификации, такие как метилирование и гликозилирование, также способствуют расширению структурного разнообразия флавонов.Например, путем введения метильной группы в сайт C7 апигенина получают одно соединение, известное как генкванин. По сравнению с апигенином генкванин проявляет множество новых свойств, включая антибактериальную активность и активность по улавливанию радикалов. Ли и др. (2015) представили апигенин 7-O -метилтрансферазу (POMT7) из Populus deltoides в штамм E. coli , избыточно продуцирующий апигенин, для создания биосинтетического пути de novo для продукции генкванина; титр генкванина достиг 41 мг / л при использовании глюкозы в качестве источника углерода.Путем введения глюкозильной группы в химическую структуру апигенина в сайте C7 продукт апигенин-7- O -β- D -глюкозид проявляет несколько дополнительных биоактивностей, таких как антипролиферативная и более высокая антиоксидантная активность. Туан и др. достигнута продукция апигенин-7- O -β- D -глюкозида из p -кумаровой кислоты в E. coli с использованием гликозилтрансферазы (PaGT3) из Phytolacca americana . Чтобы исключить образование побочных продуктов, была использована стратегия сокультивирования путем разделения всего пути на два штамма.Первый штамм содержит 4CL из Nicotiana tabacum , CHS из P. hybrida , CHI из M. sativa и FNS из Parsley для образования апигенина из p -кумаровой кислоты, тогда как второй штамм несет PaGT3 и система избыточного продуцирования UDP-глюкозы для преобразования апигенина в апигенин-7-O -β- D -глюкозид. Путем оптимизации исходного соотношения инокулята двух штаммов титр апигенин-7-O -β- D -глюкозид достиг 16.6 мг / л, что в 2,5 раза выше, чем у штамма-продуцента монокультуры (Thuan et al., 2018). Бревискапин — это неочищенный экстракт флавоноидов, выделенный из Erigeron breviscapus . Он давно используется для лечения сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний (Zhong et al., 2005). Основными активными компонентами бревискапина являются скутелларин и апигенин-7-O -глюкуронид. Лю и др. (2018) идентифицировали два ключевых фермента, участвующих в пути биосинтеза бревискапина у E.breviscapus : один представляет собой флавоноид 7- O -глюкуронозилтрансферазу, а другой — флавон-6-гидроксилазу. Введение этих двух ферментов в штамм S. cerevisiae , сверхпродуцирующий апигенин, привело к получению 108 мг / л скутелларина и 185 мг / л апигенин-7-O -глюкуронида с использованием глюкозы в качестве источника углерода (Liu et al., 2018). Совсем недавно была идентифицирована и охарактеризована гликозилтрансфераза C (Gt6CGT) из Gentiana triflora . Он проявляет значительную ферментативную активность по превращению апигенина и лютеолина в изовитексин и изоориентин соответственно.Этот фермент был соединен с сахарозосинтазой ( GmSUS ) из ​​ Glycine max для регенерации UDP-глюкозы. После оптимизации условий сопряженной реакции производство изовитексина и изоориентина достигло 3772 и 3829 мг / л с молярной степенью конверсии 97,1 и 94,7% соответственно (Pei et al., 2020).

Изофлавоны

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарны Пекинскому химико-технологическому университету.

Список литературы

Абари А. Х. и Тайеби М. (2019). Биоконверсия генистеина в оробол с помощью споры Bacillus subtilis показала тирозиназу и мониторинг противораковых эффектов оробола на раковые клетки молочной железы MCF-7. Biotechnol. Bioprocess Eng. 24, 507–512. DOI: 10.1007 / s12257-019-0067-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Акдемир, Х., Сильва, А., Жа, Дж., Загоревски, Д. В., и Коффас, М. А. Г. (2019). Производство пираноантоцианов с использованием совместных культур Escherichia coli . Metab. Англ. 55, 290–298. DOI: 10.1016 / j.ymben.2019.05.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Амор, И.Л.-Б., Хен, А., Гедон, Э., Гедира, К., Энгассер, Дж. М., Чекир-Гедрира, Л. и др. (2010). Биотрансформация нарингенина в эриодиктиол с помощью Saccharomyces cerevisiea , функционально экспрессирующей флавоноид-3′-гидроксилазу. Nat. Prod. Commun. 5, 1893–1898. DOI: 10.1177 / 1934578×1000501211

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Авереш, Н. Дж., И Кремер, Дж. О. (2018). Метаболическая инженерия пути шикимата для производства ароматических углеводородов и производных соединений — настоящие и будущие стратегии конструирования штаммов. Фронт. Bioeng. Biotechnol. 6:32. DOI: 10.3389 / fbioe.2018.00032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бано С., Джавед К., Ахмад С., Ратиш И., Сингх С., Чайтанья М. и др. (2013). Синтез некоторых новых халконов, флаванонов и флавонов и оценка их противовоспалительной активности. Eur. J. Med. Chem. 65, 51–59. DOI: 10.1016 / j.ejmech.2013.04.056

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боуэн-Форбс, К.С., Чжан Ю., Наир М. Г. (2010). Содержание антоцианов, антиоксидантные, противовоспалительные и противоопухолевые свойства плодов ежевики и малины. J. Пищевой компост. Анальный. 23, 554–560. DOI: 10.1016 / j.jfca.2009.08.012

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бритч Л. и Гризебах Х. (1986). Очистка и характеристика (2S) -флаванон-3-гидроксилазы из Petunia hybrida . Eur. J. Biochem. 156, 569–577. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1986.tb09616.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кальтаджироне С., Росси К., Погги А., Ранеллетти Ф. О., Натали П. Г., Брунетти М. и др. (2000). Флавоноиды, апигенин и кверцетин подавляют рост меланомы и метастатический потенциал. Int. J. Cancer 87, 595–600. DOI: 10.1002 / 1097-0215 ​​(20000815) 87: 4 <595 :: aid-ijc21 <3.0.co; 2-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, Т., Чао, С., и Чен, Ю.(2013). Получение производных орто -гидроксидаидзеина рекомбинантным штаммом Pichia pastoris , несущим слитый ген цитохрома P450. Process Biochem. 48, 426–429. DOI: 10.1016 / j.procbio.2013.02.014

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, К., Чанг, Ю., Ву, Дж., И Чанг, Т. (2017). Продукция и антимеланомная активность метоксиизофлавонов в результате биотрансформации генистеина двумя рекомбинантными штаммами Escherichia coli . Молекулы 22:87. DOI: 10.3390 / молекулы22010087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Корреа, М. Дж. К., Нуньес, Ф. М., Битенкур, Х. Р., Борхес, Ф. К., Гильон, Г. М. С. П., Арруда, М. С. П. и др. (2011). Биотрансформация халконов эндофитным грибом Aspergillus flavus , выделенным из Paspalum maritimum trin . J. Braz. Chem. Soc. 22, 1333–1338. DOI: 10.1590 / S0103-50532011000700019

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кресс, Б.Ф., Лейтц, К. Д., Ким, Д. К., Аморе, Т. Д., Судзуки, Д. Ю., Линхардт, Р. Дж. И др. (2017). CRISPRi-опосредованная метаболическая инженерия E. coli для продукции O-метилированного антоциана. Microb. Cell Fact. 16:10. DOI: 10.1186 / s12934-016-0623-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кушни, Т. Т., и Лэмб, А. Дж. (2011). Последние достижения в понимании антибактериальных свойств флавоноидов. Int. J. Antimicrob. Агенты 38, 99–107.DOI: 10.1016 / j.ijantimicag.2011.02.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дельмюлль, Т., Де Маеснейр, С. Л., и Де Мей, М. (2018). Проблемы микробного производства флавоноидов. Phytochem. Ред. 17, 229–247. DOI: 10.1007 / s11101-017-9515-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ди Майо, Д., Джамманко, М., Ла Гуардиа, М., Триполи, Э., Джамманко, С., и Финотти, Э. (2005). Флаваноны в цитрусовых: взаимосвязь между структурой и антиоксидантной активностью. Food Res. Int. 38, 1161–1166. DOI: 10.1016 / j.foodres.2005.05.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дин, Х., Чанг, К., Цзэн, В., и Чанг, Т. (2015). Идентификация 3′-гидроксигенистеина как мощного ингибитора меланогенеза в результате биотрансформации генистеина рекомбинантным Pichia pastoris . Process Biochem. 50, 1614–1617. DOI: 10.1016 / j.procbio.2015.06.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Донг, Дж., и Цинь, Л. (2011). Потребление изофлавонов сои и риск заболеваемости или рецидива рака груди: метаанализ проспективных исследований. Breast Cancer Res. Относиться. 125, 315–323. DOI: 10.1007 / s10549-010-1270-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдвардс Р. и Диксон Р. А. (1991). Активность изофлавон-О-метилтрансферазы в обработанных элиситором клеточных суспензионных культурах Medicago sativa . Фитохимия 30, 2597–2606.DOI: 10.1016 / 0031-9422 (91) 85107-B

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Eichenberger, M., Hansson, A., Fischer, D., Dürr, L., and Naesby, M. (2018). Биосинтез de novo антоцианов в Saccharomyces cerevisiae . FEMS Yeast Res. 18:11. DOI: 10.1093 / femsyr / foy046

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фальконе Феррейра, М. Л., Риус, С., и Касати, П. (2012). Флавоноиды: биосинтез, биологические функции и биотехнологические приложения. Фронт. Plant Sci. 3: 222. DOI: 10.3389 / fpls.2012.00222

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фазель Набави, С., Брейди, Н., Хабтемариам, С., Суреда, А., Манайи, А., и Мохаммад Набави, С. (2016). Нейропротекторные эффекты физетина при болезнях Альцгеймера и Паркинсона: от химии к медицине. Curr. Верхний. Med. Chem. 16, 1910–1915. DOI: 10.2174/1568026616666160204121725

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фаулер, З.Л., Гиканди, В. В., и Коффас, М. А. Г. (2009). Увеличение биосинтеза малонил-кофермента А за счет настройки метаболической сети Escherichia coli и его применения для производства флаванона. Заявл. Environ. Microbiol. 75, 5831–5839. DOI: 10.1128 / AEM.00270-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фокс, Дж. Э., Старчевич, М., Ков, К. Ю., Буроу, М. Е., и Маклахлан, Дж. А. (2001). Фиксация азота: эндокринные разрушители и передача сигналов флавоноидов. Природа 413, 128–130. DOI: 10.1038 / 35093163

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ганесан В., Ли З., Ван Х. и Чжан Х. (2017). Гетерологический биосинтез натурального продукта нарингенина путем совместной культивирования. Synth. Syst. Biotechnol. 2, 236–242. DOI: 10.1016 / j.synbio.2017.08.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гао, С., Лю, Ю., Цзэн, В., Ду, Г., Чжоу, Дж., И Чен, Дж.(2019). Эффективный биосинтез (2S) -нарингенина из п-кумаровой кислоты в Saccharomyces cerevisiae . J. Agric. Food Chem. 68, 1015–1021. DOI: 10.1021 / acs.jafc.9b05218

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаджимехдипур, Х., Шахрестани Р. и Шекарчи М. (2014). Изучение синергических антиоксидантных эффектов некоторых флавоноидов и фенольных соединений. Res. J. Pharmacogn. 1, 35–40.

Google Scholar

He, X., Ли, У., Блаунт, Дж. У., и Диксон, Р. А. (2008). Региоселективный синтез растительных (изо) флавоновых гликозидов в Escherichia coli . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 80, 253–260. DOI: 10.1007 / s00253-008-1554-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эредиа, Ф. Дж., Франсия-Арича, Э. М., Ривас-Гонсало, Дж. К., Викарио, И. М. и Сантос-Буэлга, К. (1998). Хроматическая характеристика антоцианов красного винограда-I. Эффект pH. Food Chem. 63, 491–498. DOI: 10.1016 / S0308-8146 (98) 00051-X

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hirvonen, T., Pietinen, P., Virtanen, M., Ovaskainen, M.-L., Häkkinen, S., Albanes, D., et al. (2001). Потребление флавонолов и флавонов и риск ишемической болезни сердца у курящих мужчин. Эпидемиология 12, 62–67. DOI: 10.1097 / 00001648-200101000-00011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоссейни-Абари, А., Ким, Б.-Г., Ли, С.-Х., Эмтиази, Г., Ким, В., и Ким, Ж.-Х. (2016). Поверхностное отображение бактериальной тирозиназы на спорах Bacillus subtilis с использованием CotE в качестве якорного белка. J. Basic Microbiol. 56, 1331–1337. DOI: 10.1002 / jobm.201600203

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг, Ю., и Хо, С. (2010). Полиметоксифлавоны отвечают за противовоспалительную активность кожуры цитрусовых. Food Chem. 119, 868–873. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2009.09.092

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хван Э. И., Канеко М., Охниши Ю. и Хориноути С. (2003). Продукция растительных флаванонов с помощью Escherichia coli , содержащего искусственный кластер генов. Заявл. Environ. Microbiol. 69, 2699–2706. DOI: 10.1128 / AEM.69.5.2699-2706.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джекман, Р. Л., Яда, Р. Ю., Тунг, М. А., и Спирс, Р.А. (1987). Антоцианы как пищевые красители — обзор. J. Food Biochem. 11, 201–247. DOI: 10.1111 / j.1745-4514.1987.tb00123.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цзян Х., Вуд К. В. и Морган Дж. А. (2005). Метаболическая инженерия фенилпропаноидного пути в Saccharomyces cerevisiae . Заявл. Environ. Microbiol. 71, 2962–2969. DOI: 10.1128 / AEM.71.6.2962-2969.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонс, Дж.А., Коллинз, С. М., Вернаккио, В. Р., Лашанс, Д. М., и Коффас, М. А. Г. (2016a). Оптимизация гидроксилирования нарингенина и п-кумаровой кислоты с использованием нативного комплекса гидроксилазы E. coli . HpaBC. Biotechnol. Прог. 32, 21–25. DOI: 10.1002 / btpr.2185

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонс, Дж. А., Вернаккио, В. Р., Синко, А., Коллинз, С. М., Ибрагим, М. Х. А., Лашанс, Д. М. и др. (2016b). Экспериментальная и вычислительная оптимизация совместной культуры Escherichia coli для эффективного производства флавоноидов. Metab. Англ. 35, 55–63. DOI: 10.1016 / j.ymben.2016.01.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонс, Дж. А., Вернаккио, В. Р., Коллинз, С. М., Ширк, А. Н., Сю, Ю., Энглендер, Дж. А., и др. (2017). Полный биосинтез антоцианов с использованием поликультуры E. coli . мБИО 8: e00621-17. DOI: 10.1128 / mBio.00621-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кальшойер, Н., Фогт, М., Стензель, А., Гетгенс, Дж., Ботт, М., и Мариенхаген, Дж. (2016). Конструирование платформенного штамма Corynebacterium glutamicum для производства стильбенов и (2S) -флаванонов. Metab. Англ. 38, 47–55. DOI: 10.1016 / j.ymben.2016.06.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кацуяма Ю., Мияхиса И., Фуна Н. и Хориноути С. (2007). Синтез генистеина из тирозина в одном горшке путем совпадения генно-инженерных клеток Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 73, 1143–1149. DOI: 10.1007 / s00253-006-0568-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кауфман, П. Б., Дюк, Дж. А., Брилманн, Х., Бойк, Дж., И Хойт, Дж. Э. (1997). Сравнительный обзор зернобобовых растений как источников изофлавонов, генистеина и даидзеина: значение для питания и здоровья человека. J. Altern. Комплемент Мед. 3, 7–12. DOI: 10.1089 / acm.1997.3.7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кей, К.Д., Хупер, Л., Крун, П. А., Римм, Э. Б., и Кэссиди, А. (2012). Относительное влияние состава, дозы и структуры флавоноидов на функцию сосудов: систематический обзор рандомизированных контролируемых испытаний пищевых продуктов, богатых флавоноидами. Мол. Nutr. Food Res. 56, 1605–1616. DOI: 10.1002 / mnfr.201200363

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кетабфоруш, С. Х., Хейроллахи, А., Сафави, М., Эсмати, Н., Ардестани, С. К., Эмами, С. и др. (2014).Синтез и оценка противораковой активности новых диметоксилированных аналогов халкона и флаванона. Arch. Pharm. 347, 853–860. DOI: 10.1002 / ardp.201400215

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хан, М. К., Аберт-Виан, М., Фабиано-Тиксье, А.-С., Данглс, О., и Чемат, Ф. (2010). Экстракция полифенолов (флаваноновых гликозидов) из кожуры апельсина ( Citrus sinensis L.) с помощью ультразвука. Food Chem. 119, 851–858.DOI: 10.1016 / j.foodchem.2009.08.046

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Д. Х., Ким, Б.-Г., Юнг, Н. Р., и Ан, Ж.-Х. (2009). Получение генистеина из нарингенина с использованием Escherichia coli , содержащего слитый белок изофлавон-синтаза-цитохром Р450-редуктаза. J. Microbiol. Biotechnol. 19, 1612–1616. DOI: 10.4014 / jmb.0905.05043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Х. П., Сын, К. Х., Чанг, Х. В., и Канг, С. С. (2004). Противовоспалительные растительные флавоноиды и механизмы клеточного действия. J. Pharmacol. Sci. 3, 229–245. DOI: 10.1254 / jphs.crj04003x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коирала, Н., Пандей, Р. П., Туан, Н. Х., Гимире, Г. П., Юнг, Х. Дж., О, Т. Дж. И др. (2019). Метаболическая инженерия Escherichia coli для производства изофлавоноид-4′-O-метоксидов и их биологической активности. Biotechnol.Прил. Biochem. 66, 484–493. DOI: 10.1002 / bab.1452

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коирала Н., Туан Н. Х., Гимире Г. П., Ван Тханг Д. и Сонг Дж. К. (2016). Метилирование флавоноидов: химическая структура, биоактивность, прогресс и перспективы биотехнологического производства. Enzyme Microb. Technol. 86, 103–116. DOI: 10.1016 / j.enzmictec.2016.02.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купман, Ф., Beekwilder, J., Crimi, B., van Houwelingen, A., Hall, R.D., Bosch, D., et al. (2012). Производство de novo флавоноида нарингенина в сконструированном Saccharomyces cerevisiae . Microb. Cell Fact. 11: 155. DOI: 10.1186 / 1475-2859-11-155

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кумар, Н. Б., Кантор, А., Аллен, К., Риккарди, Д., Бестерман-Дахан, К., Сень, Дж. И др. (2004). Особая роль изофлавонов в снижении риска рака простаты. Простата 59, 141–147. DOI: 10.1002 / pros.10362

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Х., Ким, Б. Г., Ким, М., и Ан, Ж.-Х. (2015). Биосинтез двух флавонов, апигенина и генкванина в Escherichia coli . J. Microbiol. Biotechnol. 25, 1442–1448. DOI: 10.4014 / jmb.1503.03011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонард, Э., Хемлер, Дж., Лим, К. Х., и Коффас, М.А. Г. (2006). Экспрессия растворимой флавон-синтазы позволяет биосинтез производных фитоэстрогенов в Escherichia coli . Заявл. Microbiol. Biotechnol. 70, 85–91. DOI: 10.1007 / s00253-005-0059-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонард Э. и Коффас М. А. (2007). Разработка искусственных растительных ферментов цитохрома P450 для синтеза изофлавонов с помощью Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 73, 7246–7251. DOI: 10.1128 / AEM.01411-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонард, Э., Лим, К. Х., Со, П. Н., и Коффас, М. А. Г. (2007). Разработка центральных метаболических путей для продукции высокого уровня флавоноидов в Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 73, 3877–3886. DOI: 10.1128 / AEM.00200-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонард, Э., Ян, Ю., Фаулер, З.Л., Ли, З., Лим, Ч.-Г., Лим, К. Х. и др. (2008). Улучшение штамма рекомбинантной Escherichia coli для эффективного производства растительных флавоноидов. Мол. Pharm. 5, 257–265. DOI: 10.1021 / mp7001472

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Левиссон, М., Патиниос, К., Хейн, С., де Гроот, П. А., Даран, Ж.-М., Холл, Р. Д. и др. (2018). Инжиниринг de novo Производство антоцианов в Saccharomyces cerevisiae . Microb. Cell Fact. 17: 103. DOI: 10.1186 / s12934-018-0951-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Дж., Тиан, К., Ся, Ю., Мутанда, И., Ван, К., и Ван, Ю. (2019). Производство специфичных для растений флавонов байкалеина и скутеллареина в сконструированной клетке E. coli из доступного фенилаланина и тирозина. Metab. Англ. 52, 124–133. DOI: 10.1016 / j.ymben.2018.11.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, З., Jiang, Y., Guengerich, F. P., Ma, L., Li, S., and Zhang, W. (2020). Разработка ферментных систем цитохрома P450 для биомедицинских и биотехнологических приложений. J. Biol. Chem. 295, 833–849. DOI: 10.1074 / jbc.REV119.008758

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю X., Cheng, J., Zhang, G., Ding, W., Duan, L., Yang, J., et al. (2018). Инженерные дрожжи для производства бревискапина методами геномного анализа и синтетической биологии. Nat. Commun. 9, 1–10. DOI: 10.1038 / s41467-018-02883-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли-Вебер, М. (2009). Новые терапевтические аспекты флавонов: противораковые свойства Scutellaria и его основных активных компонентов вогонин, байкалеин и байкалин. Лечение рака. Ред. 35, 57–68. DOI: 10.1016 / j.ctrv.2008.09.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лв, Ю., Эдвардс, Х., Чжоу, Дж., и Сюй П. (2019a). Комбинирование 26s рДНК и системы Cre-loxP для итеративной интеграции генов и эффективного курирования маркеров в Yarrowia lipolytica . ACS Synth. Биол. 8, 568–576. DOI: 10.1021 / acssynbio.8b00535

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lv, Y., Marsafari, M., Koffas, M.A.G., Zhou, J., and Xu, P. (2019b). Оптимизация фабрик масляных дрожжевых клеток для биосинтеза флавоноидов и гидроксилированных флавоноидов. ACS Synth.Биол. 8, 2514–2523. DOI: 10.1101 / 614099

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lv, Y., Xu, S., Lyu, Y., Zhou, S., Du, G., Chen, J., et al. (2019c). Разработка ферментных каскадов для эффективной биотрансформации эвгенола и таксифолина в силибин и изозилибин. Green Chem. 21, 1660–1667. DOI: 10.1039 / C8GC03728K

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю, X., Нг, К. Р., Ли, Дж., Марк, Р., и Чен, В. (2017). Усиление биосинтеза нарингенина из тирозина путем метаболической инженерии Saccharomyces cerevisiae . J. Agric. Food Chem. 65, 6638–6646. DOI: 10.1021 / acs.jafc.7b02507

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю X., Чжао Г., Нг, К. Р., Марк, Р. и Чен, В. (2019). Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства кемпферола de novo . J. Agric. Food Chem. 67, 5596–5606. DOI: 10.1021 / acs.jafc.9b01329

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марин, Л., Гутьеррес-дель-Рио, И., Энтриальго-Кадьерно, Р., Вильяр, К. Дж. И Ломбо, Ф. (2018). Биосинтез de novo мирицетина, кемпферола и кверцетина в Streptomyces albus и Streptomyces coelicolor . PLoS One 13: e0207278. DOI: 10.1371 / journal.pone.0207278

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марин, Л., Гутьеррес-дель-Рио, И., Ягуэ, П., Мантека, А., Вильяр, К. Дж., И Ломбо, Ф. (2017). De novo Биосинтез апигенина, лютеолина и эриодиктиола в актиномицете. Streptomyces albus и повышение продуктивности путем кормления и кондиционирования спор. Фронт. Microbiol. 8: 921. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.00921

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мигель М. Г. (2011). Антоцианы: антиоксидантное и / или противовоспалительное действие. J. Appl. Pharm. Sci. 1, 7–15.

Google Scholar

Миранда, К. Л., Стивенс, Дж. Ф., Иванов, В., МакКолл, М., Фрей, Б., Дейнзер, М. Л. и др. (2000). Антиоксидантное и прооксидантное действие пренилированных и непренилированных халконов и флаванонов in vitro . J. Agric. Food Chem. 48, 3876–3884. DOI: 10.1021 / jf0002995

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Mojica, L., Berhow, M. A., and De Mejia, E. G. (2017). Богатые антоцианином экстракты черной фасоли в качестве пищевых красителей: физико-химическая стабильность и антидиабетический потенциал. Food Chem. 229, 628–639. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2017.02.124

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Набави, С. М., Шамец, Д., Tomczyk, M., Milella, L., Russo, D., Habtemariam, S., et al. (2020). Пути биосинтеза флавоноидов в растениях: универсальные мишени для метаболической инженерии. Biotechnol. Adv. 38: 107316. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2018.11.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Надери Г. А., Асгари С., Сарраф-Задеган Г. Н. и Ширвани Х. (2003). «Антиоксидантный эффект флавоноидов на восприимчивость к окислению ЛПНП», в Vascular Biochemistry , eds G.Н. Пирс, Дж. Вигл и П. Заградка (Берлин: Springer), 193–196. DOI: 10.1007 / 978-1-4615-0298-2_27

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Накаяма Т., Ёнекура-Сакакибара К., Сато Т., Кикучи С., Фукуи Ю., Фукути-Мизутани М. и др. (2000). Ауреузидинсинтаза: гомолог полифенолоксидазы, отвечающий за окраску цветов. Наука 290, 1163–1166. DOI: 10.1126 / science.290.5494.1163

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нойкам, К., Шталь В., Тронье Х., Сиес Х. и Генрих У. (2007). Употребление какао, богатого флаванолами, резко увеличивает микроциркуляцию в коже человека. Eur. J. Nutr. 46, 53–56. DOI: 10.1007 / s00394-006-0627-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Панди, Р. П., Параджули, П., Коффас, М. А. Г. и Сонг, Дж. К. (2016). Микробиологическое производство природных и неприродных флавоноидов: разработка путей, направленная эволюция и системы / синтетическая биология. Biotechnol. Adv. 34, 634–662. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2016.02.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пей, Дж., Сун, К., Гу, Н., Чжао, Л., Фанг, X., Тан, Ф. и др. (2020). Производство изоориентина и изовитексина из лютеолина и апигенина с использованием сочетанного катализа гликозилтрансферазы и сахарозосинтазы. Заявл. Biochem. Biotechnol. 190, 601–615. DOI: 10.1007 / s12010-019-03112-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петерсон, Дж.Дж., Бичер, Г. Р., Бхагват, С. А., Дуайер, Дж. Т., Гебхард, С. Е., Хайтовиц, Д. Б. и др. (2006). Флаваноны в грейпфруте, лимонах и лаймах: сборник и обзор данных из аналитической литературы. J. Пищевой компост. Анальный. 19, S74 – S80. DOI: 10.1016 / j.jfca.2005.12.009

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Равишанкар Д., Раджора А. К., Греко Ф. и Осборн Х. М. (2013). Флавоноиды как перспективные соединения для противораковой терапии. Int.J. Biochem. Cell Biol. 45, 2821–2831. DOI: 10.1016 / j.biocel.2013.10.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Родригес, А., Струко, Т., Штальхут, С. Г., Кристенсен, М., Свенссен, Д. К., Форстер, Дж. И др. (2017). Метаболическая инженерия дрожжей для ферментативного производства флавоноидов. Биоресурсы. Technol. 245, 1645–1654. DOI: 10.1016 / j.biortech.2017.06.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сантос, К.Н.С., Коффас, М.А.Г., и Стефанопулос, Г. (2011). Оптимизация гетерологичного пути производства флавоноидов из глюкозы. Metab. Англ. 13, 392–400. DOI: 10.1016 / j.ymben.2011.02.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schroeter, H., Heiss, C., Balzer, J., Kleinbongard, P., Keen, C.L., Hollenberg, N.K., et al. (2006). (-) — Эпикатехин опосредует благотворное влияние какао, богатого флаванолами, на функцию сосудов человека. Proc.Natl. Акад. Sci. США 103, 1024–1029. DOI: 10.1073 / pnas.0510168103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шах, Ф. Л. А., Рамзи, А. Б., Бахарум, С. Н., Нур, Н. М., Го, Х.-Х., Леоу, Т. К. и др. (2019). Последние достижения в области инженерных микробов-хозяев для биотехнологического производства флавоноидов. Мол. Биол. Rep. 46, 6647–6659. DOI: 10.1007 / s11033-019-05066-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шарма, Б., Balomajumder, C., and Roy, P. (2008). Гипогликемические и гиполипидемические эффекты экстракта, богатого флавоноидами из семян Eugenia jambolana , на крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином. Food Chem. Toxicol. 46, 2376–2383. DOI: 10.1016 / j.fct.2008.03.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шреста Б., Пандей Р. П., Дарсандхари С., Параджули П. и Сонг Дж. К. (2019). Комбинаторный подход для улучшения продукции цианидин-3-O-глюкозида в Escherichia coli . Microb. Cell Fact. 18: 7. DOI: 10.1186 / s12934-019-1056-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шкергет, М., Котник, П., Хадолин, М., Граш, А. Р., Симонич, М., и Кнез, Ž (2005). Фенолы, проантоцианидины, флавоны и флавонолы в некоторых растительных материалах и их антиоксидантная активность. Food Chem. 89, 191–198. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2004.02.025

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Солопова, А., Ван Тилбург, А.Y., Foito, A., Allwood, J. W., Stewart, D., Kulakauskas, S., et al. (2019). Разработка Lactococcus lactis для производства необычных антоцианов с использованием чая в качестве субстрата. Metab. Англ. 54, 160–169. DOI: 10.1016 / j.ymben.2019.04.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штальхут, С. Г., Зидлер, С., Малла, С., Харрисон, С. Дж., Мори, Дж., Невес, А. Р. и др. (2015). Сборка нового биосинтетического пути для производства растительного флавоноида физетина в Escherichia coli . Metab. Англ. 31, 84–93. DOI: 10.1016 / j.ymben.2015.07.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тахара, С., Ингам, Дж. Л., Ханава, Ф., и Мизутани, Дж. (1991). Значение химического сдвига 1H ЯМР протона 5-гидроксила изофлавона в качестве удобного индикатора 6-замещения или 2′-гидроксилирования. Фитохимия 30, 1683–1689. DOI: 10.1016 / 0031-9422 (91) 84234-J

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Такамура, Ю.и Номура Г. (1988). Изменения внутриклеточной концентрации ацетил-КоА и малонил-КоА в зависимости от углеродного и энергетического метаболизма Escherichia coli K12. Микробиология 134, 2249–2253. DOI: 10.1099 / 00221287-134-8-2249

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Таку К., Мелби М. К., Ниши Н., Омори Т. и Курзер М. С. (2011). Изофлавоны сои при остеопорозе: научно обоснованный подход. Maturitas 70, 333–338.DOI: 10.1016 / j.maturitas.2011.09.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Туан Н. Х., Чаудхари А. К., Ван Куонг Д. и Куонг Н. Х. (2018). Инженерная система совместного культивирования для производства апигетрина в Escherichia coli . J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 45, 175–185. DOI: 10.1007 / s10295-018-2012-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tohge, T., de Souza, L.P., и Fernie, A.Р. (2017). Современное понимание путей биосинтеза флавоноидов у модельных и сельскохозяйственных растений. J. Exp. Бот. 68, 4013–4028. DOI: 10.1093 / jxb / erx177

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Torskangerpoll, K., and Andersen, ØM. (2005). Цветоустойчивость антоцианов в водных растворах при различных значениях pH. Food Chem. 89, 427–440. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2004.03.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трантас, Э., Панопулос, Н., и Верверидис, Ф. (2009). Метаболическая инженерия полного пути, ведущего к гетерологичному биосинтезу различных флавоноидов и стильбеноидов в Saccharomyces cerevisiae . Metab. Англ. 11, 355–366. DOI: 10.1016 / j.ymben.2009.07.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван Саммерен-Везенхаген, П. В., и Мариенхаген, Дж. (2015). Метаболическая инженерия Escherichia coli для синтеза растительного полифенола пиносилвина. Заявл. Environ. Microbiol. 81, 840–849. DOI: 10.1128 / AEM.02966-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Р., Чжао С., Ван З. и Коффас М. А. Г. (2020). Последние достижения в модульной инженерии совместного культивирования для синтеза натуральных продуктов. Curr. Opin. Biotechnol. 62, 65–71. DOI: 10.1016 / j.copbio.2019.09.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Т., Цай Ю., Юй И., и Чанг, Т. (2016). Улучшение продуцирования 3′-гидроксиенистеина в рекомбинантном Pichia pastoris с использованием стратегии периодического шока перекисью водорода. J. Microbiol. Biotechnol. 26, 498–502. DOI: 10.4014 / jmb.1509.09013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ватанабэ С., Уэсуги С. и Кикучи Ю. (2002). Изофлавоны для профилактики рака, сердечно-сосудистых заболеваний, гинекологических проблем и возможного повышения иммунитета. Biomed.Фармакотер. 56, 302–312. DOI: 10.1016 / S0753-3322 (02) 00182-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рольстад Р. Э. (2004). Антоциановые пигменты — Биоактивность и красящие свойства. J. Food Sci. 69, C419 – C425. DOI: 10.1111 / j.1365-2621.2004.tb10709.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, Дж., Ду, Г., Чен, Дж., И Чжоу, Дж. (2015). Повышение выработки флавоноидов путем систематической настройки центральных метаболических путей на основе системы интерференции CRISPR в Escherichia coli . Sci. Отчет 5: 13477. DOI: 10.1038 / srep13477

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, Дж., Ю, О., Ду, Г., Чжоу, Дж., И Чен, Дж. (2014). Тонкая настройка пути жирных кислот с помощью синтетической антисмысловой РНК для увеличения продукции (2S) -нарингенина из L-тирозина в Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 80, 7283–7292. DOI: 10.1128 / AEM.02411-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, Дж., Чжан, X., Донг, М., и Чжоу, Дж. (2016a). Поэтапная модульная разработка пути Escherichia coli для эффективного одностадийного производства (2S) -пиноцембрина. J. Biotechnol. 231, 183–192. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2016.06.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву Дж., Чжан Х., Чжоу Дж. И Дун М. (2016b). Эффективный биосинтез (2S) -пиноцембрина из d -глюкозы путем интеграции инженерных центральных метаболических путей со стратегией контроля pH-сдвига. Биоресурсы. Technol. 218, 999–1007. DOI: 10.1016 / j.biortech.2016.07.066

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян Ю., Хемлер Дж., Хуанг Л., Мартенс С. и Коффас М. А. Г. (2005). Метаболическая инженерия биосинтеза антоцианов у Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 71, 3617–3623. DOI: 10.1128 / AEM.71.7.3617-3623.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян Дж., Лян, Дж., Шао, Л., Лю, Л., Гао, К., Чжан, Дж., И др. (2020). Экологичное производство силибина и изосилибина путем объединения методов метаболической инженерии и ферментативного катализа. Metab. Англ. 59, 44–52. DOI: 10.1016 / j.ymben.2020.01.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжа Дж., Занг Й., Маттоцци М., Плассмайер Дж. И Коффас М. А. Г. (2018). Метаболическая инженерия Corynebacterium glutamicum для производства антоцианов. Microb. Cell Fact. 17: 143. DOI: 10.1186 / s12934-018-0990-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, J., Zhao, L., Cheng, Q., Ji, B., Yang, M., Sanidad, K. Z., et al. (2018). Структурно различные подклассы флавоноидов ослабляют метаболический синдром, индуцированный диетой с высоким содержанием жиров и фруктозы у крыс. J. Agric. Food Chem. 66, 12412–12420. DOI: 10.1021 / acs.jafc.8b03574

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжао, С., Джонс, Дж. А., Лашанс, Д. М., Бхан, Н., Халиди, О., Венкатараман, С. и др. (2015). Улучшение производства катехинов в Escherichia coli посредством комбинаторной метаболической инженерии. Metab. Англ. 28, 43–53. DOI: 10.1016 / j.ymben.2014.12.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжун, Х., Дэн, Ю., Ван, X., и Ян, Б. (2005). Состав мультивезикулярных липосом для длительной доставки бревискапина. Int. Дж.Pharm. 301, 15–24. DOI: 10.1016 / j.ijpharm.2005.04.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжоу, С., Лю, Ю., Ли, Х., Коффас, М. А. Г., и Чжоу, Дж. (2019). Тонкая настройка пути синтеза (2S) -нарингенина с использованием итеративной стратегии балансировки с высокой пропускной способностью. Biotechnol. Bioeng. 116, 1392–1404. DOI: 10.1002 / bit.26941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу, С., Ву, Дж., Ду, Г., Чжоу, Дж., и Чен, Дж. (2014). Эффективный синтез эриодиктиола из L-тирозина в Escherichia coli . Заявл. Environ. Microbiol. 80, 3072–3080. DOI: 10.1128 / AEM.03986-13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Разработка технологий производства продуктов на биологической основе из углеводов биопереработки — повторный просмотр «10 лучших» Министерства энергетики США

Разработка технологий производства продуктов на биологической основе из углеводов биопереработки — повторный просмотр «10 лучших» министерств энергетики США

Завод по биопереработке, который дополняет производство недорогого биотоплива высокоценными химическими веществами на биопереработке, может способствовать сокращению потребления невозобновляемого топлива, одновременно обеспечивая необходимый финансовый стимул для стимулирования расширения отрасли биопереработки.Однако выбор подходящих продуктов для добавления в портфель биоперерабатывающих заводов затруднен из-за отсутствия широкой технологии конверсии в сочетании с множеством потенциальных целей. В 2004 году Министерство энергетики США решило эти проблемы, описав процесс выбора химических продуктов, который сочетал идентификацию небольшой группы соединений, полученных из углеводов биопереработки, с исследованиями и технологическими потребностями, необходимыми для их производства. Цель отчета состояла в том, чтобы стимулировать исследовательские усилия по синтезу нескольких членов этой группы или, в идеале, структур, еще не включенных в список.За шесть лет, прошедших со времени выхода первоначального отчета Министерства энергетики, был достигнут значительный прогресс в использовании углеводов в качестве исходного сырья для химического производства. В этом обзоре представлена ​​обновленная оценка потенциальных целевых структур с использованием аналогичной методологии выбора и обзор технологических разработок, которые привели к включению данного соединения. Список представляет собой динамическое руководство по развитию технологий, которые могут обеспечить коммерческий успех за счет надлежащей интеграции биотоплива с продуктами на биопродукции.

У вас есть доступ к этой статье

Обзор производственного процесса — Управление цепочкой поставок | Динамика 365

• 29.09.2021
• Читать 9 минут

В этой статье

В этом разделе дается обзор производственных процессов.В нем описаны различные этапы производственных заказов, пакетных заказов и канбанов, от создания заказа до закрытия финансового периода.

Производство продуктов, процесс, который также известен как жизненный цикл производства, следует за определенными шагами, которые требуются для завершения производства элемента. Жизненный цикл начинается с создания производственного заказа, заказа партии или канбана. Он заканчивается готовым произведенным изделием, готовым либо к заказчику, либо к другому этапу производства.Каждый этап жизненного цикла требует разного рода информации для завершения процесса. По мере завершения каждого шага производственный заказ, заказ партии или канбан показывает изменение производственного статуса. Для разных типов продуктов требуются разные производственные процессы.

Модуль Контроль производства связан с другими модулями, такими как Управление информацией о продукте , Управление запасами , Главная книга , Управление складом , Учет проектов и Управление организацией .Эта интеграция поддерживает информационный поток, необходимый для завершения производства готового изделия.

На производственный процесс обычно влияют методы учета затрат и оценки запасов, которые выбираются для конкретного производственного процесса. Supply Chain Management поддерживает методы фактических затрат (первый пришел — первый ушел [FIFO]; последний пришел — первый ушел [LIFO]; скользящее среднее и периодическое средневзвешенное значение) и методы стандартных затрат. Бережливое производство реализуется на основе принципа обратной калькуляции затрат.

Выбор методов измерения затрат также определяет требования к отчетности о потреблении материалов и ресурсов в процессе производства. Как правило, методы фактических затрат требуют точной отчетности на уровне работ, тогда как методы периодической калькуляции позволяют создавать менее подробные отчеты о потреблении материалов и ресурсов.

Производство в смешанном режиме

Различные продукты и топологии производства требуют применения разных типов заказов.Supply Chain Management может применять различные типы заказов в смешанном режиме. Другими словами, все типы заказов могут выполняться в течение непрерывного процесса производства одного готового продукта.

• Производственный заказ — это классический вид заказа для производства определенного продукта или варианта продукта в заданном количестве в определенную дату. Производственные заказы основаны на спецификациях материалов (BOM) и маршрутах.
• Пакетный заказ — Этот тип заказа используется для обрабатывающих производств и дискретных процессов, где производственное преобразование основано на формуле или где побочные и побочные продукты могут быть конечными продуктами, либо в дополнение к основной, либо вместо нее. продукт.В пакетных заказах используются спецификации и маршруты типа Formula .
• Канбан — Канбан используется для обозначения повторяющихся процессов бережливого производства, основанных на производственных потоках, правилах канбана и спецификациях.
• Проект — производственный проект объединяет продукты и услуги с заданным графиком и бюджетом. Производственная часть проекта может быть доставлена ​​любым другим типом заказа.

Принципы производства

Чтобы выбрать принцип производства, который лучше всего применим к конкретному продукту и соответствующему рынку, вы должны учитывать требования производства и логистики, а также ожидания клиентов в отношении сроков доставки.

• Сделать на склад — это классический принцип производства, при котором продукты производятся на склад на основе прогноза или минимального пополнения запасов (последнее обычно рассчитывается на основе прогноза или исторического потребления).
• Изготовление на заказ — Стандартные изделия изготавливаются на заказ или готовятся к заказу. Хотя предварительное производство может быть выполнено с использованием принципа «Сделать на склад», дорогостоящие этапы цепочки создания стоимости или этапы, создающие варианты, инициируются заказом на продажу или заказом на перемещение.
• Настроить на заказ — Что касается принципа изготовления на заказ, заключительные операции цепочки создания стоимости выполняются на заказ. Фактический производимый вариант продукта не определен заранее, но создается во время ввода заказа на основе модели конфигурации продукта продажи. Принцип «Настроить на заказ» требует определенного уровня унификации процессов для данной линейки продуктов.
• Инженер по заказу — Процессы инженера по заказу обычно рассматриваются в проекте и обычно начинаются с этапа проектирования.На этапе проектирования разрабатываются и описываются фактические продукты, необходимые для выполнения заказа. Затем для производства продуктов могут быть созданы производственные заказы, серийные заказы или канбаны.

Обзор жизненного цикла продукции

Следующие этапы жизненного цикла производства могут происходить для всех типов заказов в смешанном режиме производства. Однако не все они представлены в виде явного статуса заказа.

1. Создано — Вы можете создать производственный заказ, пакетный заказ или канбан вручную, или вы можете настроить систему для их генерации на основе различных сигналов спроса.Сводное планирование создает производственные заказы, серийные заказы или канбаны путем подтверждения плановых заказов. Другими сигналами спроса являются заказы на продажу или сигналы привязки предложения от других производственных заказов или канбанов. Для канбанов с фиксированным количеством сигналы спроса генерируются, когда канбаны регистрируются как пустые.

2. Оценка — Вы можете рассчитать оценки потребления материалов и ресурсов. При оценке создаются складские проводки для сырья со статусом По заказу .Поступления для основных продуктов, сопутствующих продуктов и побочных продуктов создаются при оценке производственных заказов или заказов партии. Если спецификация содержит строки типа Обособленная поставка , создаются заказы на поставку материалов или субподрядных операционных услуг, которые привязаны к производственному заказу или заказу партии. Позиции или заказы резервируются в соответствии со стратегией резервирования производственного заказа, а цена готовой продукции рассчитывается на основе настроек параметров.

3. Запланировано — Вы можете запланировать производство на основе операций, отдельных заданий или того и другого.

   • Планирование операций — этот метод планирования обеспечивает приблизительный долгосрочный план. Используя этот метод, вы можете назначать даты начала и окончания производственным заказам. Если производственные заказы прикреплены к операциям маршрута, вы можете назначить их группам МВЗ.
   • Планирование заданий — Этот метод планирования предоставляет подробный план. Каждая операция разбита на отдельные задания с определенными датами, временем и назначенными операционными ресурсами.Если используется ограниченная емкость, задания назначаются операционным ресурсам в зависимости от доступности. Вы можете просматривать и изменять расписание на диаграмме Ганта.
   • График Канбана — Задания Канбана планируются на доске расписания Канбана или автоматически планируются на основе конфигурации автоматического планирования правил Канбана.

4. Выпущено — Вы можете деблокировать производственный заказ или заказ партии, когда график завершен и материал доступен для комплектования или подготовки.Проверка доступности материала помогает начальнику цеха оценить доступность материала для производственных или пакетных заказов. Вы также можете распечатать документы производственного заказа, такие как списки выбора, карточку задания, маршрутную карту и маршрутное задание. Когда производственный заказ деблокирован, статус заказа изменяется, показывая, что производство может быть начато. Когда используется управление складом, деблокирование производственного заказа или заказа партии передает строки производственной спецификации в управление складом.Затем в соответствии с настройками склада генерируются волны складирования и складские работы.

5. Подготовлено / Отобрано — Когда все материалы и ресурсы размещены на производственном участке, строки производственной спецификации или строки канбана обновляются до статуса Отобрано . Привязанные заказы на поставку и соответствующие складские работы обычно завершаются на этом этапе. Канбан-карты или карты заданий, необходимые для отчета о ходе производства, должны быть назначены и распечатаны.

6. Запущено — Когда запускается производственный заказ, заказ партии или канбан, вы можете сообщить о потреблении материалов и ресурсов по заказу. Систему можно настроить на автоматическую проводку расхода материалов и ресурсов, которые назначаются заказу при его запуске. Это распределение известно как предварительная очистка, прямая очистка или автопотребление. Вы можете вручную распределить материалы по производственным заказам или пакетным заказам, создав дополнительные журналы списков комплектации.Вы также можете вручную распределить трудозатраты и другие затраты на маршрут для заказа. Если вы используете планирование операций, вы можете распределить эти затраты, создав журнал маршрутных карт. Если вы используете планирование заданий, вы можете распределить затраты, создав журнал карточек вакансий. Производственные заказы или заказы партии могут быть запущены партиями запрошенного окончательного количества. В рамках производственного заказа, пакетного заказа или канбана созданные задания можно запускать и сообщать отдельно через журналы, производственный терминал (MES Terminal) или доски канбана.

7. Отчет о ходе выполнения / Завершение заданий — используйте терминал MES, производственные журналы, доски канбан или возможности мобильного сканирования, чтобы сообщать о ходе производства по заданиям или ресурсам. Будет проводиться расход материалов и ресурсов, а статус связанных канбанов, производственных и пакетных заказов может быть обновлен до Получено или Отмечено как завершенное . Работа по размещению на складе может быть создана в зависимости от конфигурации склада.

8. Отмечено как готовое (поступление продукта) — Когда производственный заказ или заказ партии сообщается как завершенный, количество готовой продукции, которая была завершена, обновляется в запасах. Это количество включает количество соответствующих побочных продуктов и побочных продуктов. Если вы используете учет незавершенного производства (НЗП), создается журнал бухгалтерской книги, чтобы уменьшить счета НЗП и увеличить запасы готовой продукции. Когда рассчитывается стоимость производственного заказа, проводится фактическая стоимость производства.Если затраты на материалы и труд, связанные с производством, еще не распределены в журнале или предварительной промывкой, они могут быть автоматически распределены посредством обратной промывки. Распределение посредством обратной промывки включает пост-вычет процессов складских операций. Если производственный заказ выполнен, установите флажок Завершить задание , чтобы изменить оставшийся статус на Завершено . В противном случае оставьте поле пустым, чтобы включить отчет о дополнительных объемах производства.

9. Оценка качества — Поступление продукта может инициировать создание заказов на качество в зависимости от конфигурации процессов тестирования и правил качества, установленных для конкретных продуктов. Поскольку заказ качества может обновлять статус запасов или атрибуты партии тестируемых продуктов, оценка качества является обязательным процессом во многих отраслях.

10. Размещение на складе и Отгрузка по заказу — После получения продукта и оценки качества дополнительная работа по размещению направляет полученные продукты в следующую точку потребления, на склад готовой продукции или в зону отгрузки, если таковые имеются. требования к отгрузке на заказ.

11. Окончание — Перед окончанием производства фактические затраты рассчитываются для произведенного количества. Все предполагаемые затраты на материалы, рабочую силу и накладные расходы сторнируются и заменяются фактическими затратами. Если вы установите флажок Завершить задание при выполнении расчета стоимости, статус производственного заказа изменится на Завершено . Этот статус предотвращает разноску любых дополнительных затрат по выполненному производственному заказу.

12. Закрытие периода — Некоторые принципы учета затрат, такие как периодическая средняя, ​​обратная калькуляция, FIFO или LIFO, требуют периодических действий для закрытия запасов или финансового периода.Обычно система пытается сообщить обо всем потреблении материалов и ресурсов, а также о корректировках запасов и брака до закрытия периодов. Эта отчетность обычно выполняется с использованием журналов движения запасов или журналов корректировки. Цель состоит в том, чтобы оценить экономические показатели операционных подразделений за период. В некоторых случаях, когда используются долгосрочные производственные заказы, охватывающие периоды финансовой отчетности, производственные журналы используются для отчета о ходе производства и потреблении ресурсов к концу периода.

Дополнительные ресурсы

Отзывы о производстве

Обзор моделей конфигурации продукта

Обзор бережливого производства

ProductionFor | Видеопроизводство и анимация

«Мы не перестаем играть, потому что стареем, мы стареем, потому что перестаем играть» — Джордж Бернард Шоу

В детстве Клинту сказали, что у него был «дар болтливости». ‘, внутренняя способность взаимодействовать и находить точки соприкосновения с людьми самых разных типов и возрастов.Сегодня он по-прежнему заинтересован, любознателен и жаждет узнать, что другие люди и что ими движет. Вдумчивое общение принесло ему лучшие отношения, это величайшее защитное оружие, которое он носит, и движущая сила его успеха.

Он на собственном примере убедился, что в характере есть сила, терпимость, принятие, вежливость и внимательность. Гордится терпением, вниманием к деталям и решимостью никогда не сдаваться, применяет эту стойкость ко всему, что он делает, и свой дар болтливости ко всем, кого встречает.

Коммуникация всегда играла важную роль в выборе его карьеры, открывая возможности и помогая ему преодолевать жизненные сюрпризы. В колледже он специализировался на массовых коммуникациях. То, к чему он или его профессора в то время не могли подготовиться, так это к приближению технологического цунами, которое ликвидирует пробелы, соединит культуры и изменит способ нашего общения.