Обращение об устранении нарушений прав и законных интересов

Обращение об устранении нарушений прав и законных интересов — НАО «ПКБ»

НАО «ПКБ» уделяет особое значение построению равноправных и партнерских отношений между Бюро и заемщиком, допустившим возникновение просроченной задолженности, что является основой бесконфликтного разрешения ситуации.

Сотрудники Бюро готовы работать с каждым заемщиком индивидуально, определяя совместно с заемщиком оптимальный путь погашения возникшей задолженности.

Открытая и конструктивная позиция заемщика в процессе погашения своей задолженности позволяет добиться оптимальных условий для каждой из сторон и избежать возникновения правовых последствий взыскания кредитной задолженности в судебном порядке.

Работа Бюро с заемщиком начинается с официального обращения к заемщику, содержащего информацию о существующей задолженности, возможных способах ее погашения и предложением погасить ее в максимально короткий срок

Если Вы или Ваша компания получили письмо-уведомление (sms-сообщение, телефонный звонок из call-центра Компании), то обязательно СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ и это позволит оперативно разрешить возникшую ситуацию.

В разделе Вопросы и Ответы мы постарались собрать все важные вопросы о работе Бюро с заемщиками и надеемся, что этот раздел поможет вам ответить на все вопросы этой темы.

Денежные средства в погашение Задолженности по Договору, необходимо перечислять на расчетный счет НАО «ПКБ» Узнайте точную сумму своего долга без общения, в режиме онлайн, затем определите оптимальную программу для погашения задолженности Ознакомьтесь с собственной историей кредитов, обратившись в кредитное бюро

Узнать размер задолженности онлайн – узнайте размер задолженности по кредиту онлайн

Знать размер задолженности по кредиту важно не только в процессе его погашения, но и после, чтобы внезапно не получить уведомление о неуплате. Нередки случаи, когда заемщики оказываются должны банку уже после выплаты долга, забыв оплатить комиссию или банковскую операцию. Получать каждый раз справку о погашении в банке неудобно и невыгодно, поэтому оптимальный вариант — узнать размер задолженности онлайн.

Способы узнать задолженность перед банком

В основе всех типов финансовых отношений лежит документирование всех операций и процедур, поэтому, чтобы получить информацию о состоянии задолженности по кредиту, нужно:

• лично обратиться в отделение банка;
• связаться с кредитным консультантом организации по телефону;
• сделать письменный запрос;
• проверить через банкомат или терминал;
• отправить СМС с запросом на номер банка;
• обратиться в ФССП;
• обратиться в БКИ;
• посмотреть через персональный кабинет на сайте организации.

Механизм взаимодействия заемщика и кредитора отличается в зависимости от способа обращения. Часто в пакете документов договора указываются возможные способы узнать состояние долгов. Если такой памятки нет, ее можно получить, обратившись в банк, но наиболее удобным вариантом будет узнать размер задолженности через Интернет, введя персональные данные, логин, пароль и номер договора на сайте банка.

Как проверить долги по кредиту онлайн

Узнать о состоянии задолженности можно не только на сайте кредитора, но и обратившись в Бюро кредитных историй через сайт Центрального банка РФ. Для этого нужно указать ФИО, серию паспорта и дату его выдачи, номер кредитного договора и адрес электронной почты.

Недостатком такого способа узнать размер задолженности является то, что в России действует 16 БКИ, и определить, в базе данных какого именно отделения хранится информация, непросто. Для этого нужно знать код субъекта, который указывается при подписании договора. Если он отсутствует, его можно создать, отправив запрос через портал услуг ЦБ РФ. Получить данные из БКИ бесплатно можно только один раз за год, тогда как остальные обращения будут уже платными.

Как общаться с коллекторами – узнайте, как построить разговор с коллекторами, на сайте НАО «ПКБ»

2019-03-01T00:00:00+03:00 2020-04-28T16:39:35+03:00 Как общаться с коллекторами

Привлечение коллекторского агентства для взыскания задолженности — распространенная практика среди банков и МФК (микрофинансовых компаний), которые таким образом пытаются минимизировать затраты и вернуть хоть какие-то деньги. Для заемщика это возможность договориться о более удобных условиях погашения кредита, но для этого нужно уметь правильно общаться с коллекторами.

Как разговаривать с коллекторами

Не каждая просрочка является поводом для кардинальных мер, но если заемщик уклоняется от исполнения кредитных обязательств более 90 дней, банк вправе привлечь коллекторское бюро на условиях:

• агентского договора: компания представляет интересы банка и работает за процент от взысканной суммы;
• договора цессии: агентство получает право требования задолженности и становится новым кредитором заемщика.

Единственным методом работы коллекторов является правовое воздействие на клиента путем информирования о последствиях неуплаты и решения спора в судебном порядке. Это возможно согласно статьям закона № 353-ФЗ, который определяет права и обязанности займодателя и займополучателя. Коллекторы могут представлять интересы банка в суде по агентскому договору или самостоятельно подавать иск на клиента-должника в случае цессии.

Независимо от формы привлечения коллекторов, заемщик должен быть уведомлен об этом, в противном случае он имеет право не исполнять требования нового кредитора до предоставления документов, подтверждающих право требования. При первом звонке сотрудника коллекторской компании нужно попросить его представиться, сообщив имя и фамилию, должность и полное название фирмы. При этом разговор может быть записан на диктофон, что не противоречит Гражданскому кодексу, если вторая сторона уведомлена об этом.

Обязательным для заемщика является требование копии агентского договора или договора цессии, а также всех бумаг, необходимых ему для погашения кредита. Эти документы должны быть представлены по первому требованию и иметь печати организаций, заключивших соглашение, что определено статьей 385 ГК РФ. Также можно потребовать представить уставные документы коллекторской компании и ознакомиться с отзывами о ее работе в Интернете. Коллекторское бюро обязательно должно иметь лицензию ФССП, иначе его деятельность незаконна.

После того, как право требования задолженности подтверждено, клиент может начинать разговаривать с коллекторами и договариваться об изменении графика платежей по кредиту или реструктуризации долга. Лучше, конечно, начать взаимодействовать раньше. Как правило, коллекторы идут на уступки, если у неплательщика есть обоснованные причины задержки платежей и он готов в дальнейшем выполнять свои кредитные обязательства.

Почему кредитор сразу не подает в суд?

С момента возникновения задолженности банк передает проблемный заём вначале своему собственному юридическому отделу, затем коллекторам, и, только если вернуть деньги в досудебном порядке не получается, следует судебный иск. Невыгодность такого способа возврата долга заключается в том, что после начала искового производства происходит расторжение кредитного договора, означающее прекращение начисления процентов и штрафов.

Судебное разбирательство может длиться не один месяц, а требуемая сумма долга остается неизменной, что делает ее возврат все менее выгодным. Несовершенство законодательной базы позволяет должнику затягивать процесс без серьезных последствий, и банк никак не может на это повлиять. Кроме этого, суд может частично принять сторону неплательщика, списав из суммы задолженности проценты или штрафы, которые были признаны неправомерными. В итоге кредитор получает право требовать только тело кредита и проценты, начисленные до начала судебного производства, что за вычетом затрат на юристов и сопровождение дела в суде делает конечную выгоду мизерной.

Другая причина нежелания кредитора решать вопрос в судебной плоскости — отсутствие подписанного заемщиком кредитного договора. Это возможно в случае карточного кредита, который не имеет письменного согласия получателя. Коллекторы редко связываются с подобными займами, так как шансы вернуть деньги даже через суд минимальны. Но подобное манипулирование судебной системой может плохо кончиться для неплательщика, если кредитор докажет факт злостного уклонения от исполнения долговых обязательств и мошенничества.

Выгоды от передачи долга коллекторам

Несмотря на негативный фон, который сформировался вокруг коллекторских компаний, переуступка задолженности позволяет заемщику получить выгодные условия для возврата кредита. В случае тяжелого материального положения клиента или других уважительных причин коллекторы готовы:

• предоставить рассрочку;
• провести реструктуризацию;
• составить новый график платежей;
• предложить удобные способы оплаты.

Всего этого можно достичь путем переговоров и знания своих прав в общении с коллекторами.

Платить ли коллекторам долг по кредиту – узнайте, как оплатить долги коллекторам

1970-01-01T03:00:00+03:00 2020-04-28T16:39:35+03:00 Как правильно платить долг коллекторам по кредиту?

Как правильно платить долг коллекторам по кредиту?

Передача проблемного кредита коллекторам позволяет банку избавиться от сложностей судебного разбирательства, а клиенту-должнику найти выгодные способы погасить задолженность. В большинстве случаев платить долг коллекторам удобнее и быстрее, но вначале нужно разобраться, на каких основаниях они требуют оплаты и законны ли эти требования.

Законна ли передача долга коллекторам?

Право кредитора привлекать третью сторону для взыскания задолженности определено в главе 24 Гражданского кодекса РФ. Поводом может стать просрочка по займу, превышающая 90 дней, и нежелание клиента добровольно возвращать средства, а также мошенничество. При этом коллекторы могут не выкупать долг, а работать на принципах аутсорсинга по агентскому договору, представляя интересы банка. Если была осуществлена переуступка права требования долга, то коллекторская компания должна предоставить договор цессии и новые реквизиты для внесения платежей.

Способы работы коллекторов

Работа коллекторов ведется строго в рамках Федерального закона № 230 других нормативно-правовых актов, а главным их оружием являются переговоры и юридическая работа. Оба метода работы можно разделить на два этапа:

1. Досудебный. Собирается информация о клиенте, после чего работа с ним ведется по телефону, через СМС, визиты домой и на работу в установленное законом время.
2. Судебный. Кредитор (теперь им может являться и коллектор) подает в суд с требованием взыскать задолженность принудительно, посредством конфискации имущества, ареста банковских средств и других активов.

Коллекторы имеют право подавать в суд только в случае заключения договора цессии или заверенного права представительства банка в судебных инстанциях. Но даже в таком случае их работа сводится к передаче данных и подготовке документов на этапе искового производства, после чего возможно начало искового производства в отношении неплательщика.

Избежать принудительного возврата долга по исполнительному листу можно, если идти на контакт с коллекторами и попробовать изменить условия погашения кредита. При наличии уважительных причин они готовы пойти на уступку и предоставить отсрочку, провести реструктуризацию или даже списать часть долга. Но прежде чем договариваться с юристами коллекторского бюро и платить по новым реквизитам, заемщику нужно получить:

• копию договора цессии;
• сертификат ФССП;
• копию кредитного договора.

Кредитор обязан предоставить эти сведения самостоятельно в течение нескольких дней после заключения договора цессии.

Как оплатить кредит коллекторам

Погашение задолженности коллекторской компании предполагает разные способы оплаты с возможностью выбрать наиболее удобный и выгодный. Возможны следующие способы оплаты:

1. Отделение коллекторской компании. Если филиал организации находится недалеко от места жительства, то клиент может вносить платежи наличными, что предусмотрено кредитным договором. После внесения средств обязательно нужны чек или квитанция.
2. Терминал самообслуживания (QIWI). Для оплаты клиенту нужно выбрать раздел «Услуги» и найти там название фирмы, после чего указать номер договора (или ID ПКБ — уникальный идентификатор каждой задолженности, внесенной в базу) и внести средства для оплаты.
3. Приложение «Сбербанк Онлайн». Большинство коммерческих организаций являются клиентами Сбербанка, поэтому для оплаты задолженности клиент может использовать его приложение, выбрав раздел «Переводы и платежи».

«Первое коллекторское бюро» предлагает своим клиентам оплатить долг по кредиту прямо на сайте:

• по номеру кредитного договора ПКБ;
• по личным данным: ФИО;
• через личный кабинет https://my.collector.ru.

С платежей не взимается комиссия, а для оплаты потребуется подключение к Интернету и несколько минут свободного времени.

Получение справки об отсутствии задолженности

После погашения долга заемщику обязательно нужно получить справку об отсутствии задолженности, которая подтвердит выплату кредита и избавит от необоснованных претензий со стороны кредитора в дальнейшем. Документ не имеет установленного образца, а поэтому может отличаться в разных компаниях. Несмотря на это, в нем обязательно должны присутствовать:

• данные о клиенте;
• официальное название коллекторской компании;
• данные договора, дата оформления и номер;
• подтверждение отсутствия задолженности;
• дата выдачи или оформления;
• печать и подпись уполномоченного сотрудника.

Заказать справку об отсутствии долга на сайте «Первого коллекторского бюро» можно, указав личные данные и номер кредитного договора или ID ПКБ. Данная услуга бесплатна, а срок рассмотрения запроса и изготовления справки составляет 3–5 дней.

Вся правда о первой коллекторской ассоциации

На сегодняшний день в России существует лишь две коллекторские ассоциации: «Ассоциация по Развитию Коллекторского Бизнеса» и «Национальная Ассоциация Профессиональных Коллекторских Агентств». Самой первой в нашей стране была зарегистрирована АРКБ, именно о ней и пойдет речь в статье.

Основная цель АРКБ — становление и поддержка нового для России профессионального сообщества коллекторских организаций, взаимодействие с законодательными органами с целью выработки новых законопроектов, способствующих поддержанию и развитию коллекторского бизнеса в России, формирование высоких стандартов качества оказываемых коллекторскими организациями услуг, консолидация сил в борьбе с недобропорядочным партнерством и мошенничеством. Все это необходимо для становления и формирования в России цивилизованного, прозрачного и качественного рынка коллекторских услуг, заявляется на сайте АРКБ.

Ассоциация по Развитию Коллекторского Бизнеса была основана в июле 2006 года. На сегодняшний день членами Ассоциации стали 35 организаций. Редакция газеты «Долговой Фактор» пообщалась с некоторыми из них, с целью выяснить насколько выполняются цели и задачи, поставленные перед АРКБ. Наши корреспонденты задали одинаковые вопросы представителям коллекторских агентств.

Нашими респондентами стали: Алексей Игин – генеральный директор «Агентства по Возврату Кредитных Долгов» (г. Москва), Илья Фомин – генеральный директор Бюро кредитной безопасности «Русколлектор» (г. Москва), Светлана Горюнова — менеджер проекта Компании «ЭОС» (г. Москва), Сергей Мамедов – генеральный директор «Межрегионального долгового центра» (г. Москва), Николай Довгий – начальник отдела методологии и контроля инкассации проблемной задолженности «Первого коллекторского бюро» (г. Хабаровск), Владимир Лях – генеральный директор Коллекторского агентства «ВоИн» (г. Новосибирск), Сергей Скупов – генеральный директор «Коллекторского агентства «Таймер» (г. Чебоксары), Сергей Беляев – генеральный директор «Сибирской коллекторской группы» (г. Иркутск).

Основная цель деятельности АРКБ, заявленная в открытых источниках, направлена на становление и поддержку коллекторских организаций, лично вашему агентству, в чем оказывается поддержка?

Илья Фомин: АРКБ проводит мероприятия, в которых принимают участие большое количество коллекторских агентств. Благодаря этому появилась возможность обмениваться между собой определенной информацией, методами работы, обсудить коммерческие вопросы. Наверно именно это можно рассматривать как некую поддержку. Если же говорить индивидуально, лично нашему агентству наверно нет поддержки.

Светлана Горюнова: Поддержку мы сможем оценить, когда нас начнут приглашать на мероприятия, проводимые АРКБ. На сегодня активной помощи от них нет. Деятельность АРКБ, ее задачи, цели – замечательные, но хотелось бы увидеть более активную помощь. Хочется, чтобы нас информировали о том, что происходит в коллекторской сфере, о мероприятиях, в которых мы можем принять участие.

Николай Довгий: АРКБ формирует единое научное информационное поле. Мы имеем возможность обмениваться с другими агентствами информацией. Кроме того, Ассоциация плотно работает над защитой интересов коллекторов на уровне государства. Все это очень важно.

Сергей Мамедов: Нашему агентству – разве, что в рекламе. Но это скорее наше упущение, они постоянно предлагают участие в мероприятиях, но пока у нас нет времени и возможности активно участвовать.

Владимир Лях: Благодаря деятельности АРКБ, происходит популяризация нашей работы, мы имеем возможность встречаться с коллегами из других регионов, обмениваться опытом.

Сергей Скупов: Информационную поддержку АРКБ нам оказывает, и что еще не маловажно – обучающую. Вот мы скоро летим на IV ежегодную Всероссийскую конференцию.

Сергей Беляев: Во-первых — информационную поддержку, во-вторых – АРКБ следит за исполнением и продвижением основных стандартов нашей работы.

Оказывает ли АРКБ Вам правовую помощь в работе по обслуживанию клиентов?

Светлана Горюнова: Нет. Мы только примерно полгода назад стали членами АРКБ, может быть, поэтому они просто еще не успели оказать нам такую помощь.

Николай Довгий: В большинстве случаев мы обходимся своими силами, но если возникнет вопрос, требующий дополнительной консультации, мы можем обратиться в АРКБ, и они нам помогут.

Владимир Лях: Мы с этим не сталкивались, не обращались к ним с этим вопросом, но думаю, если появится необходимость, нас проконсультируют.

Сергей Скупов: Если мы обращаемся за консультацией, то, несомненно, получаем ответ.

Сергей Беляев: На сегодняшний день – нет.

Способствует ли Ассоциация развитию сотрудничества вашего агентства с зарубежными партнерами?

Илья Фомин: Как мне известно, Сергей Рахманин сейчас ведет переговоры с крупнейшей ассоциацией, объединяющей европейские агентства. Но пока это в стадии переговоров, поэтому преждевременно говорить о том, что для нас это послужит развитием сотрудничества с международными агентствами.

Светлана Горюнова: Пока не способствует, но будем надеяться.

Николай Довгий: Мы пока осваиваем отечественный рынок, дальше будет видно.

Владимир Лях: Мы не работаем с зарубежными компаниями, наше географическое положение препятствует этому.

Сергей Скупов: С зарубежными мы пока не сотрудничаем. А вот по развитию сотрудничества с региональными агентствами АРКБ оказывает помощь.

Сергей Беляев: У нас пока не было такой необходимости. Но АРКБ развивает сотрудничество между региональными агентствами, являющимися ее членами. Ассоциация организовывает диалог между нами.

Учувствуете ли Вы в обучающих семинарах, проводимых АРКБ, если да, то существенна ли получаемая от этого польза; если нет, то почему?

Илья Фомин: Мы не участвуем в семинарах, у нас есть внутренние обучающие программы для своих сотрудников, поэтому для нас нет необходимости посещать семинары, проводимые АРКБ.

Светлана Горюнова: Еще не участвовали. Мы только недавно получили первое приглашение, наши представители обязательно посетят это мероприятие. Только после того, как агентство узнает, какого рода информацию они предоставляют, мы сможем оценить насколько это для нас интересно и полезно.

Николай Довгий: Мы принимаем участие в семинарах. Они проводятся на очень высоком уровне, они достаточно уникальны.

Владимир Лях: Участвуем, получаем методические пособия. Ведь АРКБ занимается разрабатыванием методик по взысканию задолженностей. Это помогает в работе.

Сергей Скупов: Сотрудники агентства участвуют в семинарах, и это приносит нам пользу.

Сергей Беляев: Участвуем. На следующей неделе наши сотрудники посетят один из семинаров. Это существенная помощь, мы получаем методические рекомендации.

Некоторые люди считают АРКБ – ассоциацией одного человека, и что цель организации – зарабатывание денег на модном бизнесе, как вы относитесь к этим высказываниям?

Алексей Игин: Эти высказывание не имеют никаких оснований. Это единственная Ассоциация в России, членами которой являются агентства со всей страны. На сегодня АРКБ выполняет социальные функции, она занимается не только работой с агентствами, но и с заемщиками – по вопросам финансового образования. Поэтому так высказываться в их адрес неправильно.

Илья Фомин: Я так не считаю. На мой взгляд, Сергей Рахманин тратит очень много сил и времени на работу АРКБ, благодаря этому в Ассоциацию вступило так много организаций. Безусловно, в рамках этой работы происходит какой-то PR его и его компании, но это нормально. Тем более, что другие участники допущены к работе, поэтому здесь есть баланс.

Светлана Горюнова: Лично я не разделяю такого мнения, может мы не вдавались так подробно в историю создания АРКБ. Мы хотели вступить в Ассоциацию, которая бы способствовала нашему развитию и поддерживала нас. Надеемся, что АРКБ оправдает надежды.

Николай Довгий: Заявления не обоснованы. Мы ощущаем для нас значимость Ассоциации. Членов у АРКБ очень много, и в принципе мы не замечали того, чтобы Ассоциация носила какие-то персональные цели в своей деятельности. У нас претензий нет.

Сергей Мамедов: Ровно тоже самое можно сказать про любую Ассоциацию. Я бы не сказал, что это слишком модный и простой бизнес. Модный можно было сказать году в 2005, а сейчас эта рутина, которой нужно заниматься профессионально.

Владимир Лях: Модным этот бизнес не назовешь, он очень тяжелый. Как можно сказать, что это бизнес одного человека? Мы независимая компания, которая сама изъявила желание стать членами АРКБ, это добровольное дело.

Сергей Скупов: АРКБ – ассоциация одного человека? Ну, тогда я не знаю этого человека, который один все создал и использует Ассоциацию для личных целей.

Сергей Беляев: Я считаю, что это неверное высказывание. АРКБ выполняет все свои задачи и цели не во благо одного человека, а во благо всех членов. Помощь, которую мы запрашиваем, поступает вовремя и в полном объеме.

На основе полученных ответов, можно сделать вывод, что у каждого агентства есть своя позиция в отношении АРКБ. Несмотря на то, что не каждое коллекторское агентство, согласившееся ответить на наши вопросы, устраивает работа Ассоциации, они не спешат из нее выходить, а значит, эти компании видят какие-то перспективы.

Валентина Фомина
Газета Долговой фактор 16 апреля 2008 17:59

ПКБ — это… Что такое ПКБ?

ПКБ

коммерческий банк «Петрокоммерц»

с 1992

ОАО

http://www.pkb.ru/​

организация, фин.

ПКБ

пулемёт Калашникова бронетранспортёрный

бронетанковый

транспорт

Словари: Словарь сокращений и аббревиатур армии и спецслужб. Сост. А. А. Щелоков. — М.: ООО «Издательство АСТ», ЗАО «Издательский дом Гелеос», 2003. — 318 с., С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.

ПКБ

пожарный кран бытовой

Словарь: Словарь сокращений и аббревиатур армии и спецслужб. Сост. А. А. Щелоков. — М.: ООО «Издательство АСТ», ЗАО «Издательский дом Гелеос», 2003. — 318 с.

ПКБ

проектно-конструкторское бюро

Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.

ПКБ

плуг кустарниково-болотный

Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.

ПКБ

Партия конгресса Басуто

Лесото

Лесото, полит.

ПКБ

Партия коммунистов Белорусская

Беларусь, полит.

ПКБ

психиатрическая клиническая больница

мед.

ПКБ

Первый клиентский банк

http://1cb.ru/​

банк., организация

ПКБ

Пивоваренная компания «Балтика»

ОАО

http://baltika.ru/​

организация, Санкт-Петербург

ПКБ

Первое коллекторское бюро

ОАО

http://www.collector.ru

г. Хабаровск, фин.

ПКБ

пылевидно-кварцевый песок марки Б

Источник: www.bcconsul.ru/bbs/203/55.htm

ПКБ

«Первое кредитное бюро»

с 2004

ТОО

Казахстан

Источник: http://www.expert.ru/printissues/kazakhstan/2006/47/kreditnoe_byuro/

ПКБ

Приволжское кредитное бюро

с 2004
ранее: СКБ

ЗАО

организация

Источник: http://www.press-volga.ru/pvnews/2005/12/15/3/m_article_print.html

Словарь сокращений и аббревиатур. Академик. 2015.

Глава Северного ПКБ: ракеты «Циркон» — наш козырь на очень серьезную перспективу

22 апреля исполняется 75 лет со дня основания Северного ПКБ. Это одно из крупнейших российских проектно-конструкторских бюро, образованное в 1946 году. Оно создает надводные корабли различных классов, в том числе сторожевики проекта 11356, новейшие фрегаты проекта 22350, модульные патрульные корабли проекта 22160. Накануне этой даты генеральный директор предприятия Андрей Дьячков рассказал в интервью ТАСС о том, над чем сейчас работают специалисты ведущего КБ России.

— Андрей Аркадьевич, над каким проектами работает Северное ПКБ в год своего 75-летнего юбилея?

— Со дня основания деятельность бюро была направлена на выполнение гособоронзаказа с целью повышения боеспособности советского Военно-морского флота. Сегодня специалисты бюро продолжают работу по обеспечению строительства серии фрегатов проекта 22350, а также сторожевых кораблей проекта 22160.

Ведутся модернизационные работы на крейсере «Адмирал Нахимов». Кроме того, очень серьезное направление нашей деятельности — это военно-техническое сотрудничество. Корабли, созданные в СПКБ, поставлялись в иностранные флоты начиная с конца 1950-х годов. Сегодня мы продолжаем осуществлять работы по реализации ряда контрактов с инозаказчиком.

— В чем заключается основная идея модернизации тяжелого атомного ракетного крейсера «Адмирал Нахимов» и нужны ли российскому флоту подобные ракетные крейсеры?

— Несмотря на появление новых современных кораблей, «кораблей XXI века», тяжелые атомные ракетные крейсеры проектов 1144 и 11442, спроектированные в Северном ПКБ, к которым относится, в частности, и «Адмирал Нахимов», по-прежнему являются «визитной карточкой», своеобразным символом не только нашего бюро, но и ВМФ России.

На эту тему

Высокий модернизационный потенциал этих кораблей, заложенный в них при проектировании, позволил провести определенные работы и оснастить «Адмирала Нахимова» самым современным оружием, что делает его сильнейшим боевым надводным кораблем мира. Это не раз отмечали в своих отчетах и рейтингах и иностранные специалисты, что можно отследить по публикациям в различных СМИ.

Несомненно, еще долгое время корабли с ракетным вооружением будут оставаться основной составляющей всех военных флотов мира. Вопрос заключается в том, каким оружием, какими комплексами мы будем оснащать корабли, создаваемые для ВМФ РФ, которые, по сути, являются для них платформами, носителями вооружения.

В 2020 году с борта спроектированного Северным ПКБ фрегата «Адмирал Горшков» был произведен первый успешный пуск гиперзвуковой ракеты «Циркон». «Циркон» — это наш сегодняшний козырь на очень серьезную перспективу. Характеристики этого комплекса пока еще никто не смог превзойти, и сегодня он выводит наш флот на совершенно новый уровень. Флот постоянно развивается, в том числе и за счет принятия на вооружение новых комплексов вооружения, а это означает, что в будущем боевые корабли будут иметь совершенно новые качества, нежели сегодня.

— Какие-то проекты Северного ПКБ сегодня проходят модернизацию, помимо «Адмирала Нахимова»?

— Следует отметить, что все корабли, спроектированные специалистами нашего бюро, обладают заложенным при проектировании высоким потенциалом модернизации. В 2020 году завершены ремонт и модернизация большого противолодочного корабля проекта 1155 «Маршал Шапошников». На него были установлены новые комплексы вооружения, значительно повысившие боевые возможности проекта. Теперь он может выполнять задачи ударного корабля дальней морской зоны.

— Запланировано продолжение серии фрегатов проекта 22350. Будут ли новые корабли серии отличаться от предыдущих?

— Фрегат проекта 22350 «Адмирал Горшков», головной в серии, привлек к себе пристальное внимание специалистов всего мира в 2019 году, когда он совершил кругосветный поход, что было признано достижением и занесено в Книгу рекордов Вооруженных сил Российской Федерации. Подобные операции не проводились со времен распада Советского Союза. Во время похода корабль доказал свои отличные ходовые качества и надежность, правильность заложенных в него инженерных решений.

Вскоре фрегаты проекта 22350 должны стать основой надводных группировок флота России. В настоящее время продолжаются работы над шестью кораблями серии. Новые фрегаты  будут отличаться составом вооружения, что существенно усилит потенциал как самих кораблей, так и группировок, в состав которых они войдут, придаст им новые возможности и позволит решать дополнительные задачи.

Кроме того, те корабли, которые сегодня строятся серийно, будут иметь, в отличие от головного фрегата, полностью отечественную главную энергетическую установку

— Будет ли продолжение у серии кораблей 22460 для пограничников?

— На сегодняшний момент Пограничной службе ФСБ России передано уже более десяти кораблей. Все они прекрасно себя зарекомендовали. Их ходовые качества, условия обитаемости позволяют им эффективно выполнять задачи на всех морях, практически в любых условиях. Корабли проекта 22460 служат сегодня и на Черном море, и на Севере. В этом году на Международном военно-морском салоне, который пройдет в Санкт-Петербурге в конце июня, мы покажем обновленный проект корабля, который будет существенно отличаться от тех, что уже построены.

— В СМИ сообщалось, что возможно продолжение строительства сторожевых кораблей проекта 22160. Что поменяется в кораблях, которые будут строиться после первых шести?

— Первые шесть кораблей серии строились в соответствии с техническим заданием, которое было выдано нам заказчиком — ВМФ РФ. Именно под  цели и задачи, им определенные, и был выбран оптимальный состав вооружения и оборудования корабля.

В дальнейшем, если у заказчика появится потребность в наличии дополнительного количества кораблей проекта 22160 и для них будут определены дополнительные задачи, то, соответственно, будет проведен «рестайлинг» проекта, он получит новые возможности.

Причем сделать это будет относительно несложно, поскольку все наши корабли спроектированы как базовые платформы с открытой архитектурой с возможностью установки разных комплексов вооружения и систем

За счет этого данный проект привлекателен и для инозаказчиков, поскольку позволяет реализовать их требования применительно к установке того набора вооружения и оборудования, который они посчитают оптимальным для себя.

— Какие версии российских кораблей вам приходилось адаптировать для иностранных заказчиков? В чем заключалась такая адаптация? Когда были созданы эти проекты? Корабли уже поставлены заказчикам?

— Бюро имеет богатую историю военно-технического сотрудничества с зарубежными странами. Начиная с 1957 года созданные в СПКБ корабли поставлялись Болгарии, Польше, ГДР, Египту, Индонезии, Финляндии, Вьетнаму. Особого внимания заслуживает тема сотрудничества с Республикой Индия и КНР.

На основании распоряжения Совета Министров СССР в 1975 году Северному ПКБ было поручено разработать проект противолодочного корабля с ударными возможностями для Республики Индия. В результате в 1980–1988 годах заказчику было передано пять кораблей проекта 61МЭ.

В 1997–1999 годах для ВМС Республики Индия был разработан принципиально новый фрегат проекта 11356. В 2003–2004 годах и в 2012–2013 годах две серии из трех кораблей в каждой переданы ВМС Индии.

В 1996-м специалисты Северного ПКБ разработали проект патрульно-сторожевого корабля ПС-500, который в 2001-м передали ВМС Республики Вьетнам. В 1997 году в Бюро началась разработка технического проекта двух эскадренных миноносцев проекта 956Э. Эти корабли были переданы Китайской Народной Республике в 1999–2000 годах.

По результатам успешного сотрудничества с КНР в январе 2002 года был заключен новый контракт на разработку документации и поставку еще двух кораблей проекта 956ЭМ с усовершенствованными комплексами ударного и зенитного вооружения. Корабли были построены и переданы ВМС КНР в 2005 и 2006 годах соответственно.

Без преувеличения можно сказать, что создание основы ВМС Китая и становление индийского военно-морского флота — заслуга специалистов Северного ПКБ. В настоящий момент продолжается работа по реализации ряда контрактов с инозаказчиком.

pKb Определение в химии

pK _b — отрицательный десятичный логарифм основной константы диссоциации (K _b ) раствора. Он используется для определения прочности щелочного или щелочного раствора.

pKb = -log ₁₀ K _b
Чем меньше значение pK _b , тем сильнее база. Как и в случае с константой диссоциации кислоты, pK _a , расчет константы диссоциации основания является приближением, которое является точным только в разбавленных растворах.Kb можно найти по следующей формуле:

K _b = [B ⁺ ] [OH ^–] / [BOH]

которое получается из химического уравнения:

BH ⁺ + OH ^— ⇌ B + H ₂ O

Нахождение pKb из pKa или Ka

Константа диссоциации основания связана с константой диссоциации кислоты, поэтому, если вы знаете одну, вы можете найти другое значение. Для водного раствора концентрация гидроксид-иона [OH ^— следует соотношению концентрации иона водорода [H ⁺ ] «K _w = [H ⁺ ] [OH ^—

Помещение этого отношения в уравнение K _b дает: K _b = [HB ⁺ K _w / ([B] [H]) = K _w / K _a

.

При одинаковой ионной силе и температуре:

pK _b = pK _w — pK _a .

Для водных растворов при 25 ° C pK _w = 13,9965 (или около 14), поэтому:

pK _b = 14 — pK _a

Пример расчета pKb

Найдите значение константы диссоциации основания K _b и pK _b для водного раствора слабого основания с pH 9,5 0,50 дм ^-3 .

Сначала рассчитайте концентрацию ионов водорода и гидроксида в растворе, чтобы получить значения, которые нужно включить в формулу.

[H ⁺ ] = 10 ^-pH = 10 ^-9,5 = 3,16 x 10 ^–10 моль дм ^–3

K _w = [H ⁺ _(водн.) ] [OH ^— _(водн.) ] = 1 x 10 ^–14 моль ² дм ^–6

[OH ^— _(вод.) ] = K _{w /} [H ⁺ _(вод.) ] = 1 x 10 ^–14 / 3,16 x 10 ^–10 = 3 .16 x 10 ^–5 моль дм ^–3

Теперь у вас есть необходимая информация для определения базовой константы диссоциации:

K _b = [OH ^— _(водн.) ] ² _/ [B _(водн.) ] = (3,16 x 10 ^–5 ) ² / 0,50 = 2,00 x 10 ^–9 моль дм ^–3

pK _b = –log (2,00 x 10 ^–9 ) = 8.70

pH, pKa, Ka, pKb и Kb объяснены

В химии есть соответствующие шкалы, которые используются для измерения кислотности или щелочности раствора, а также силы кислот и оснований. Хотя шкала pH наиболее известна, pKa, Ka, pKb и Kb являются общими расчетами, которые позволяют лучше понять кислотно-основные реакции. Вот объяснение терминов и того, чем они отличаются друг от друга.

Что означает буква «p»?

Всякий раз, когда вы видите «p» перед значением, например pH, pKa или pKb, это означает, что вы имеете дело с -log значения, следующего за «p».Например, pKa — это логарифм Ka. Из-за того, как работает функция журнала, меньшее значение pKa означает большее значение Ka. pH — это логарифм концентрации ионов водорода и т. д.

Формулы и определения для pH и константы равновесия

pH и pOH связаны так же, как Ka, pKa, Kb и pKb. Если вы знаете pH, вы можете рассчитать pOH. Если вам известна константа равновесия, вы можете вычислить остальные.

О pH

pH — это мера концентрации ионов водорода [H +] в водном (водном) растворе.Шкала pH варьируется от 0 до 14. Низкое значение pH указывает на кислотность, pH 7 — нейтральный, а высокое значение pH указывает на щелочность. Значение pH может сказать вам, имеете ли вы дело с кислотой или основанием, но оно предлагает ограниченное значение, указывающее на истинную силу кислоты основания. Формулы для расчета pH и pOH:

pH = — log [H +]

pOH = — log [OH-]

При 25 градусах Цельсия:

pH + pOH = 14

Понимание Ka и pKa

Ka, pKa, Kb и pKb наиболее полезны при прогнозировании того, будет ли вид отдавать или принимать протоны при определенном значении pH.Они описывают степень ионизации кислоты или основания и являются истинными индикаторами силы кислоты или основания, поскольку добавление воды к раствору не изменяет константу равновесия. Ka и pKa относятся к кислотам, а Kb и pKb относятся к основаниям. Как и pH и pOH, эти значения также учитывают концентрацию ионов водорода или протонов (для Ka и pKa) или концентрацию гидроксид-иона (для Kb и pKb).

Ka и Kb связаны между собой ионной постоянной для воды, Kw:

Ka — константа диссоциации кислоты.pKa — это просто -log этой константы. Точно так же Kb — это константа диссоциации оснований, а pKb — логарифм константы. Константы диссоциации кислоты и основания обычно выражаются в молях на литр (моль / л). Кислоты и основания диссоциируют по общим уравнениям:

• HA + H ₂ O ⇆ A ^— + H ₃ O ⁺
• HB + H ₂ O ⇆ B ⁺ + OH ^—

В формулах A означает кислоту, а B — основание.

• Ka = [H +] [A -] / [HA]
• pKa = — лог Ка
• в половине точки эквивалентности, pH = pKa = -log Ka

Большое значение Ka указывает на сильную кислоту, потому что это означает, что кислота в значительной степени диссоциирована на свои ионы. Большое значение Ka также означает, что образование продуктов в реакции благоприятствует. Небольшое значение Ka означает, что кислота мало диссоциирует, поэтому у вас слабая кислота. Значение Ka для большинства слабых кислот колеблется от 10 ^-2 до 10 ^-14 .

PKa дает ту же информацию, только по-другому. Чем меньше значение pKa, тем сильнее кислота. Слабые кислоты имеют pKa от 2 до 14.

Общие сведения о Kb и pKb

Kb — константа диссоциации оснований. Константа диссоциации основания — это мера того, насколько полностью основание диссоциирует на составляющие ионы в воде.

• Кб = [B +] [OH -] / [BOH]
• pKb = -log КБ

Большое значение Kb указывает на высокий уровень диссоциации сильного основания.Более низкое значение pKb указывает на более сильное основание.

pKa и pKb связаны простым соотношением:

Что такое pI?

Еще один важный момент — pI. Это изоэлектрическая точка. Это pH, при котором белок (или другая молекула) электрически нейтрален (не имеет чистого электрического заряда).

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference-between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса ! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference-between -pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: HTTP-запрос не удался! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference- между-pka-и-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference- between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http: // files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference-between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference- between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в / home / diffbw / webapps / diffbw_wp / awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference-between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открытый поток: HTTP-запрос не удался! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Механизм активации PKB / Akt ингибитором протеинфосфатазы Каликулин A

Abstract

Белок кальцикулин-A-ингибитор / Akt до ~ 50% активности, индуцированной инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1) в клетках HeLa, способствующей очевидному увеличению фосфорилирования Ser473, несмотря на очевидное отсутствие фосфорилирования Thr308 PKB.Тем не менее, активация PKB, индуцированная каликулином A, по-видимому, зависит от базальных уровней фосфорилирования Thr308, поскольку PDK1-зависимый механизм необходим для зависимой от каликулина A активации PKB с использованием эмбриональных стволовых клеток, полученных от мышей дикого типа PDK1 и мышей с нокаутом. Представленные данные свидетельствуют о том, что индуцированное каликулином А фосфорилирование Ser473 в значительной степени блокировалось ингибиторами LY294002 и SB-203580, что указывает на то, что как PI3-киназа / TORC2-зависимая, так и SAPK2 / p38-зависимая протеинкиназы способствовали фосфорилированию Ser473 в обработанных каликулином A клетки.Кроме того, наши результаты предполагают, что каликулин А блокирует IGF1-зависимое фосфорилирование Thr308 и активацию PKB, вероятно, из-за повышенного фосфорилирования Ser612 субстрата 1 рецептора инсулина (IRS1), что может ингибировать его активацию PI3-киназы, что является обязательным требованием. для PDK1-индуцированного фосфорилирования Thr308 и IGF1-зависимой активации PKB. Наши данные предполагают, что активность PKB больше всего зависит от уровня фосфорилирования Ser473, а не Thr308, но базовые уровни фосфорилирования Thr308 являются обязательными.Кроме того, мы предполагаем, что каликулин А регулирует IGF1-зависимую активацию PKB, контролируя уровни фосфорилирования IRS1 Ser / Thr, ассоциированные с PI3-киназой.

Электронные дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1007 / s12013-010-9101-4) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Ключевые слова: PKB, Akt, фосфорилирование, ингибитор протеинфосфатазы

Введение

Протеинкиназа B (PKB / Akt) опосредует клеточные ответы на инсулин, факторы роста и другие стимулы и не регулируется при заболеваниях, включая рак [1 –5].PKB принадлежит к подсемейству протеинкиназ AGC и существует у млекопитающих в трех изоформах (α, β и γ; Akt1, 2 и 3). В клетках, стимулированных инсулином или инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1), PKB активируется по многоступенчатому механизму [5, 6]. Фосфоинозитид-3-киназа (PI3-киназа) генерирует PI (3,4,5) P ₃ на плазматической мембране, которая рекрутирует PKB на плазматическую мембрану и вызывает конформационные изменения. Затем PKB фосфорилируется фосфоинозитид-зависимой киназой-1 (PDK1) по остатку треонина (Thr308 в PKBα / Thr309 в PKBβ) в петле активации каталитического домена, в то время как отдельная киназа фосфорилирует Ser473 (в PKBα) в пределах гидрофобного мотива. (HM) в С-концевой области.Хотя молекулярная идентичность киназы (-ов) Ser473 все еще исследуется, недавние данные свидетельствуют о том, что нечувствительная к рапамицину форма млекопитающих-мишени рапамицина (mTOR) в комплексе (называемом TORC2) с белками, включая Rictor и GβL, опосредует фосфорилирование Ser473 в ответ на инсулин и IGF1 [7]. Некоторые другие киназы, в том числе митоген-активированная протеинкиназа-активированная протеинкиназа 2 (MAPKAP-K2) и ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-PK), могут фосфорилировать Ser473 in vitro [8, 9].Однако MAPKAP-K2 не может быть инсулино-чувствительной PDK2, поскольку фосфорилирование Ser473 с помощью MAPKAP-2 не зависит от 3-фосфорилированных липидов инозита, а препарат SB-203580 предотвращает активацию MAPKAP-K2, но не блокирует стимулированное инсулином фосфорилирование Ser473 in vivo [8]. Многие эксперименты показывают, что фосфорилирование Thr308 / 309 с помощью PDK1 является необходимым для активации PKB. Напр., PKBα не активируется и не фосфорилируется на Thr308 в ответ на IGF1 в эмбриональных стволовых (ES) клетках мыши PDK1 ^{— / —} [10].

Поэтому мы были удивлены, обнаружив, что когда лишенные сыворотки клетки HeLa обрабатывали каликулином A или окадаиновой кислотой, двумя мощными ингибиторами PP1, PP2A и родственных протеиновых (серин / треониновых) фосфатаз, PKB становился высоко фосфорилированным по Ser473 и активировался. , хотя оказалось, что существуют только базальные уровни фосфорилирования Thr308. Точно так же ранее сообщалось, что PKB активируется фактором некроза опухоли альфа (TNFα) в клетках WEHI-164 с помощью механизма, включающего фосфорилирование Ser473, но не Thr308 [11], и литий активировал PKB в нейронах, по-видимому, без фосфорилирования Thr308 [12].Каким образом это отсутствие фосфорилирования Thr308 может быть согласовано с важной ролью PDK1-катализируемого фосфорилирования Thr308 для активации PKB с помощью инсулина и IGF1 [13]? Здесь загадка того, как каликулин A активирует PKB, была дополнительно изучена на клетках HeLa и ES-клетках мышей дикого типа и PDK1 ^{— / —} .

Наши данные предполагают, что стехиометрическое фосфорилирование Ser473 с базальным фосфорилированием Thr308 поддерживает активацию PKB в клетках, стимулированных каликулином А.Между тем в клетках, стимулированных IGF1, каликулин A снижает IGF1-зависимое фосфорилирование Thr308 и активацию PKB, вероятно, за счет индукции Ser / Thr фосфорилирования субстрата 1 рецептора инсулина (IRS1), что снижает чувствительность IGF1-зависимой стимуляции PKB.

Материалы и методы

Материалы

Каликулин A, SB-203580, рапамицин и LY294002 были от Calbiochem (CN Biosciences, Великобритания), U0126 от Promega, IGF1 от Life Technologies. Реагенты для культивирования тканей и предварительно залитые гели Novex были от Invitrogen, а белок G-сефароза и активированная CH-сефароза были от Amersham Pharmacia Biotech.

Антитела

Антитела, распознающие киназу p70-S6 (изоформа 1) и остатки 466–480 PKBα / Akt1 (всего PKB на вестерн-блоттинге) были описаны ранее [13, 14]. Антитела против фосфо-FKHRL1 (FOXO3a) (pThr32) были от Millipore. Антитела против фосфо-PKB (pSer473; продукт 9271), фосфо-PKB (pThr308; продукт 9275), фосфо-GSK-3 α / β (pSer21 / 9), киназы фосфо-p70-S6 (pThr412), p44 / p42 MAPK (pThr202 / pTyr204), фосфо-p38 MAPK (pThr180 / pTyr182), фосфо-IRS1 (pSer612) и общее анти-IRS1 были от Cell Signaling Technology.Антитела, которые иммунопреципитируют PKBα, очищали стандартными процедурами в MRC Protein Phosphorylation Unit. Антитела, иммунопреципитирующие PDK1 и MAPKAP-K2, были описаны ранее [15, 16]. Вторичные антитела, связанные с пероксидазой хрена, были от компании Promega. Все антитела использовали в соответствии с рекомендациями производителей.

Культура клеток, стимуляция и лизис клеток

Клетки HeLa поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% (об.) фетальную бычью сыворотку в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C. ES-клетки мыши PDK1 ^{+ / +} и PDK1 ^{— / —} получали и поддерживали, как описано [13]. Проверку идентичности клеточных линий проводили [17]. Клетки либо хранили в среде DMEM / сыворотка до сбора урожая, либо переносили в бессывороточную среду DMEM на 3 часа (клетки HeLa) или 2 часа (клетки PDK1 ^{+ / +} и PDK1 ^{— / —} ES). Когда добавляли, каликулин А (200 нМ) добавляли в течение периода сывороточного голодания или в течение эквивалентного времени в среде, содержащей сыворотку.Где включен, IGF1 (100 нг / мл) добавляли к клеткам с недостатком сыворотки на 15 мин. Где указано, следующие ингибиторы протеинкиназ добавляли к клеткам, лишенным сыворотки, на дополнительные 60 мин: LY294002 (100 мкМ), U0126 (10 мкМ), SB-203580 (10 мкМ). Рапамицин вводили на 30 мин (100 нМ).

Клетки экстрагировали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис (pH 7,5), 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% (об. / Об.) Triton X-100, 10 мМ β-глицерофосфат, 50 мМ фторид натрия, 1 мМ. ортованадат натрия, 5 мМ пирофосфат натрия, 0.27 М сахароза, 1 мМ бензамидин, 0,2 мМ ФМСФ, 10 мкг / мл лейпептина и 0,1% (по объему) 2-меркаптоэтанол. Лизаты центрифугировали при 13000 g в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатанты быстро замораживали и хранили при -80 ° C до использования. Концентрации белка определяли методом Брэдфорда, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Активность протеинкиназ, иммунопреципитированных из клеточных лизатов

Размороженные лизаты (300 мкг белка) осветляли центрифугированием, а PDK1 иммунопреципитировали по установленной методике [13].PKB иммунопреципитировали из лизатов (200 мкг белка) с 10 мкг антитела, связанного с 10 мкл белка G-сефарозы, и анализировали активность PKB в иммунопреципитатах [14]. Активность MAPKAP-K2 оценивали, как описано ранее [18]. Тесты на PI3-киназу in vitro в целом следовали ранее описанному методу [19]. Для всех киназ одной единицей было количество, которое катализирует фосфорилирование 1 нмоль субстрата за 1 мин.

Статистический анализ

Независимые эксперименты были объединены, когда коэффициент дисперсии можно было считать идентичным.Статистическая значимость оценивалась с использованием t -теста Стьюдента ( n = количество экспериментов). Значения P менее 0,05 считались значимыми.

Результаты и обсуждение

PKBα в клетках, обработанных каликулином A, распознается фосфоспецифическими антителами pSer473-PKBα

Используя фосфоспецифическое антитело pSer473-PKBα, мы обнаружили, что каликулин A предотвращает дефосфорилирование клеток HePKB, когда PKB были эндогенными клетками Ser473. переведены из сыворотки-содержащей в бессывороточную среду (рис.). В соответствии с предыдущими сообщениями [20, 21], каликулин А сам по себе способствовал сильному фосфорилированию Ser473 в бессывороточной среде в отсутствие других индукторов (рис.). Сходным образом каликулин А стимулировал фосфорилирование киназы p70-S6 по Thr412, который находится в гидрофобной области и аналогичен Ser473 в PKB [5, 22].

Клетки HeLa, обработанные каликулином А, способствуют повышенному фосфорилированию Ser473 в PKBα. Клетки HeLa, выращенные в сыворотке, обрабатывали каликулином A (200 нМ) в течение 3 часов или переносили в бессывороточную среду на 3 часа при обработке с каликулином A (200 нМ) или без него.Где указано, клетки стимулировали IGF1 (100 нг / мл) в течение 15 минут перед сбором. Лизаты белков разделяли на 10% гелях SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали указанными антителами. Это репрезентативный блот аналогичных экспериментов, проведенных в двух экземплярах. Был проведен денситометрический анализ и выполнено вычисление соотношений фосфо / общее количество различных киназ.

Фосфорилирование Ser473 на PKBα, индуцированное каликулином А, ингибируется как LY294002, так и SB-203850

Сильное фосфорилирование Ser473 PKB может быть вызвано тем, что Каликулин А блокирует протеинфосфатазу, дефосфорилирующую этот сайт.Однако, в то время как PP2A может дефосфорилировать pSer473 in vitro [23], другие данные указывают на то, что pSer473 дефосфорилируется с помощью PH-домена, содержащего протеинфосфатазу (PHLPP), принадлежащую к нечувствительному к каликулину A классу PPM ферментов, связанных с PP2C [24]. Возможно, что PHLPP косвенно ингибируется каликулином A. В любом случае киназа (ы) Ser473 должна быть хотя бы немного активна, чтобы каликулин A индуцировал накопление фосфата на этом участке.

Чтобы идентифицировать киназы, ответственные за фосфорилирование Ser473 в клетках, обработанных каликулином А, мы предварительно инкубировали клетки с ингибиторами протеинкиназы перед добавлением каликулина А в клеточную среду.Ингибитор передачи сигналов PI3-киназа / Akt / mTOR, LY294002 [25], в значительной степени ингибировал фосфорилирование Ser473, стимулированное каликулином А, что согласуется с индуцированным каликулином А фосфорилированием Ser473, что, по крайней мере, частично зависит от активности киназы. ниже PI3-киназы, предположительно мишени рапамицинового комплекса 2 (TORC2) (рис. а).

SB-203580 и LY294002 частично подавляют активацию PKB, вызванную каликулином А, и фосфорилирование Ser473. Клетки HeLa переносили в бессывороточную среду и, где указано, обрабатывали IGF1 (100 нг / мл) в течение 15 мин перед сбором.Кроме того, следующие ингибиторы протеинкиназ были добавлены на дополнительный 1 час: LY294002 (100 мкМ), U0126 (10 мМ), SB-203580 (10 мкМ), тогда как рапамицин (100 нМ) был добавлен на 30 минут. После этого добавляли каликулин А (200 нМ) еще на 30 мин и клетки лизировали. a Белковые лизаты (25 мкг белка) разделяли на 10% SDS-PAGE гелях, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали указанными антителами. b Клетки лизировали, и PKBα иммунопреципитировали из лизатов и анализировали.Активности — среднее ± стандартное отклонение ( n = 3, * P = 0,004, ** P = 0,00065, *** P = 0,00067, Студент t -тест). c Клетки лизировали, и киназу p70-S6 иммунопреципитировали из лизатов и анализировали. Активности — среднее ± стандартное отклонение ( n = 3, * P = 0,0045, ** P = 0,0065, *** P = 0,0024, Student t -тест). Был проведен денситометрический анализ и выполнено вычисление соотношений фосфо / общее количество различных киназ.

SB-203580, специфический ингибитор SAPK2 / p38α / β [26], также частично блокировал фосфорилирование Ser473, индуцированное каликулином А (рис.а). Каликулин A стимулировал фосфорилирование SAPK2 / p38α / β в сайтах, фосфорилирование которых необходимо для активации, а именно Thr180 и Tyr182 (фиг.), А также активировал MAPKAP-K2, который находится ниже SAPK2 / p38 (данные не показаны). Эти данные показывают, что путь SAPK2 / p38α / β / MAPKPAP-K2 также способствует активации PKB каликулином А, что согласуется с предыдущими сообщениями об активации MAPKAP-K2, стимулированной окадаевой кислотой [27], и что MAPKAP-K2 может фосфорилировать Ser473. PKB in vitro [28–30].

Ни рапамицин, нацеленный на определенные формы mTOR [31], ни U0126, который ингибирует активацию митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK / ERK) [32], не влияют на фосфорилирование Ser473 (рис. А), хотя каликулин А способствует фосфорилированию и активации MAPK (фиг. и данные не показаны). Для сравнения, IGF1-зависимое фосфорилирование PKB в присутствии этих ингибиторов было включено в дополнительную информацию (дополнительный рисунок 1).

Каликулин А также способствовал активации PKB в клетках HeLa, хотя и в меньшей степени, чем IGF1 (рис.б,). Подобно фосфорилированию Ser473, каликулин А-индуцированная активация PKB была частично блокирована LY 294002 и частично SB-203580 (рис. B), подтверждая вклад PI3-киназы и SAPK2 / p38-зависимых киназ. LY294002 и SB-203580 вместе не полностью блокировали каликулин A фосфорилирование Ser473 (не показано) и активацию PKB (рис. B), однако, это указывает на то, что третий путь киназы может способствовать фосфорилированию этого сайта в каликулине A- обработанные клетки.Напротив, индуцированное каликулином А фосфорилирование киназы p70-S6 на Thr412 и активация этого фермента полностью блокировались LY294002 и рапамицином (рис. C) и, следовательно, зависели от PI3-киназы / mTOR. Однако SB-203580 не блокировал ни индуцированное каликулином А фосфорилирование Thr412, ни активацию киназы p70-S6, что указывает на то, что эти события не зависят от SAPK2 / p38-зависимых киназ. Эти данные подтверждают предыдущий отчет, предполагающий, что сульфат цинка активирует PI3-киназу, MAPK, JNK, SAPK2 / p38 и киназу p70-S6 в нейронах, причем стимуляция фосфорилирования киназы p70-S6 в основном зависит от ингибиторов рапамицина и LY294002 [33].Несколько лет назад в сообщении было высказано предположение, что каликулин А предотвращает опосредованную рапамицином и сорбитолом дезактивацию киназы p70-S6; Таким образом, было высказано предположение, что осмотический стресс и рапамицин действуют через каликулин А-чувствительную фосфатазу, вызывая дефосфорилирование и дезактивацию киназы p70-S6 [34]. Кроме того, другие сообщения предполагают, что для дефосфорилирования киназы p70-S6, вызванного рапамицином или аминокислотной депривацией, необходима чувствительная к каликулин A фосфатаза, что свидетельствует о прямом взаимодействии протеинфосфатаза-2A (PP2A) / p70-S6 киназа; кроме того, инактивация активности киназы p70-S6 посредством PP2A-зависимого механизма приводит к ингибированию синтеза белка в эндотелиальных клетках [35, 36].

Каликулин А способствует активации PKBα. Клетки HeLa, выращенные в сыворотке, инкубировали в течение 3 ч в отсутствие ( сыворотка ) или в присутствии 200 нМ каликулина А ( сыворотка + Caly A ). Клетки HeLa, перенесенные в бессывороточную среду в течение 3 часов, инкубировали с каликулином A ( Caly A ) (200 нМ в течение 3 часов), IGF1 ( IGF1 ) (100 нг / мл в течение 15 минут) или с обоими ( Caly A + IGF1 ), как указано. Клетки лизировали, PKBα иммунопреципитировали из лизатов и анализировали.Активности представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3, * P = 0,035, Student t -тест)

Каликулин A способствует фосфорилированию GSK-3α, GSK-3β и FOXO3a

Каликулин A индуцировал фосфорилирование GSK-3α, GSK-3β и FOXO3a на сайтах, которые, как известно, фосфорилируются PKB в ответ на IGF1 (рис. [37, 38]). FOXO3a представлял собой мазок снизу вверх на вестерн-блоттинге образцов, обработанных каликулином А, что, вероятно, свидетельствует о множественном фосфорилировании этого белка.Повсеместно экспрессируемый белок GSK-3 является конститутивно активным; однако его активность заметно снижается после фосфорилирования Ser21 GSK3α и Ser9 GSK3β с помощью PKB, тогда как события дефосфорилирования, опосредованные C (2) -церамид ( N -ацетил-сфингозин) -зависимой стимуляцией PP2A, стимулируют активацию GSK3 [39]. ]. Фосфорилирование GSK-3α, GSK-3β и FOXO3a согласуется с активностью PKB в этих клетках.

PKB в клетках, обработанных каликулином A, не распознается антителами pThr308-PKBα

Несмотря на сильное фосфорилирование Ser473 и активацию PKB, которые были индуцированы каликулином A, только базальный уровень Thr308 фосфорилирования PKB в каликулине A- Обработанные клетки HeLa детектировали с использованием фосфоспецифического антитела pThr308-PKBα (фиг., б,). Когда клетки HeLa переносили в бессывороточную среду, стимуляция каликулином А активировала PKB до ~ 50% активности, индуцированной IGF1, что было примерно такой же активностью, как при непрерывном росте клеток в сыворотке (рис.). Кроме того, активность PKB в клетках, обработанных как IGF1, так и каликулином A, была примерно такой же, как и в клетках, подвергшихся воздействию только каликулина A, показывая заметное снижение фосфорилирования Thr308 по сравнению со стимуляцией только IGF1 (фиг.,). Таким образом, индуцированная каликулином А активация PKB сопровождалась сильным фосфорилированием Ser473, тогда как каликулин А, по-видимому, блокировал IGF1-зависимое фосфорилирование Thr308 (рис.). Кроме того, наблюдение, что каликулин A подавлял индуцированную сывороткой активность PKB, можно объяснить тем, что каликулин A может блокировать фосфорилирование Thr308 и активацию PKB в ответ на факторы роста, присутствующие в среде, содержащей сыворотку, на тех же уровнях, что и каликулин A, снижает фосфорилирование Thr308 и активация PKB в ответ на IGF1. Более того, интригует тот факт, что каликулин A, используемый в бессывороточной среде, способствует более высокой активации PKB, чем в клетках, стимулированных сывороткой, тем не менее, наши ощущения указывают на быструю инактивацию сывороточно-зависимого фосфорилирования Thr308, опосредованного каликулином A.Это может быть отражено в быстром стимулировании снижения активности PKB по сравнению с активностью, обнаруженной в клетках, стимулированных каликулином А в бессывороточной среде.

Аналогичные результаты были получены для PKB в обработанных каликулином A клетках 3T3-L1, распознаваемых pSer473-PKBα, но не антителом pThr308-PKBα [20, 21]. Каликулин А и окадаиновая кислота предотвращали фосфорилирование Thr308 в ответ на цитокиновый гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, но не ингибировали фосфорилирование Ser473 [40].Однако наши результаты противоречат результатам Yamada et al [41], которые сообщили, что каликулин A продлевает стимулируемое инсулином фосфорилирование Thr308 в клетках яичников китайского хомячка.

То, что каликулин А запускает активацию PKB на очевидном базальном уровне фосфорилирования Thr308, вызывает недоумение, учитывая, что фосфорилирование Thr308 PKB с помощью PDK1, как много раз сообщалось, является обязательным для активации PKB [8, 10, 42].

PKBα не активируется каликулином A в PDK1

^{— / —} ES клетках

Возможность того, что активация PKBα каликулином A не требует PDK1 и фосфорилирования Thr308, была исключена, когда мы исследовали фосфорилирование и активность PKB в ответ к каликулину А в ES-клетках мыши PDK1 ^{+ / +} и PDK1 ^{— / —} [10] (рис.). Как и ожидалось [10], PKB был активирован, а Thr308 и Ser473 фосфорилировались в ответ на IGF1 в клетках PDK1 ^{+ / +} (рис.), Тогда как в клетках PDK1 ^{— / —} IGF1 стимулировал фосфорилирование Ser473, но не индуцировал Фосфорилирование Thr308 или активация PKB (рис.). Интересно отметить, что общий PKB был намного меньше в PDK1 ^{— / —} , чем в PDK1 ^{+ / +} ES клетках, вероятно, из-за отсутствия PDK1, который может каким-то образом влиять на уровни экспрессии PKB.

PKBα не активируется каликулином A в ES-клетках мыши PDK1 ^{— / —} . ES-клетки PDK1 ^{+ / +} и PDK1 ^{— / —} выращивали в присутствии сыворотки ( Сыворотка ). Некоторые клетки переносили в бессывороточную среду на 2 часа в отсутствие (, без сыворотки ) или в присутствии 200 нМ каликулина А ( Caly A ), и где указанные клетки инкубировали в течение 15 минут в присутствии 100 нг. / мл IGF1. Клетки лизировали, PKBα иммунопреципитировали из лизатов и анализировали.Активности представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3, * P = 0,03, Student t -тест). Кроме того, лизаты белков разделяли на 10% SDS-PAGE гелях, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали указанными антителами. Был проведен денситометрический анализ и выполнено вычисление соотношений фосфо / общее количество различных киназ.

Подобно клеткам HeLa, каликулин A стимулировал активную PKB, индуцированную до ~ 50% от индуцированной IGF1 в клетках PDK1 ^{+ / +} ES, которая была примерно такой же, как при непрерывном росте клеток в сыворотке.Согласно данным, полученным на клетках HeLa (рис.), Активность PKB в клетках PDK1 ^{+ / +} ES, обработанных как IGF1, так и каликулином A, была примерно такой же, как и в клетках, подвергшихся воздействию только каликулина A (рис.), В то время как Наблюдается сильное фосфорилирование Ser473 и заметное снижение фосфорилирования Thr308 по сравнению с одной стимуляцией IGF1. Для сравнения отметим, что хотя активность PKB в клетках, обработанных каликулином A, была аналогична активности в клетках, выращенных из сыворотки, иммунореактивность PKB, индуцированная pThr308-PKBα, была заметно меньше, чем активность PKB, экстрагированная из клеток, выращенных из сыворотки (рис.). Эти данные предполагают, что повышенное фосфорилирование Ser473 при базовых уровнях фосфорилирования Thr308 может поддерживать уровни активации PKB, аналогичные тем, которые обнаруживаются в физиологических условиях роста сыворотки. Тем не менее, несмотря на очевидное чрезвычайно низкое фосфорилирование Thr308, активация PKB каликулином A не может быть полностью обусловлена ​​фосфорилированием Ser473, потому что PDK1 является необходимым. Таким образом, следы фосфорилирования Thr308, по-видимому, необходимы, потому что в обработанных каликулином А клетках PDK1 ^{— / —} не наблюдалось активности PKB, даже при наличии сильных уровней фосфорилирования Ser473 (рис.).

Каликулин A способствует фосфорилированию IRS1 Ser612 и ингибирует IGF1-стимулированную IRS1-ассоциированную PI3-киназу

Когда IGF1 и каликулин A тестировались в комбинации, активация PKB была не выше, чем активация одного ингибитора протеинфосфатазы (фиг. .,). Точно так же Schubert et al [40] сообщили, что окадаиновая кислота активирует PKB и предотвращает любую дополнительную активацию в ответ на цитокиновый гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор в клетках TF-1.Чтобы понять, почему каликулин А блокирует любую дальнейшую активацию PKB IGF1, были проанализированы ферменты PDK1 и PI3-киназа в пути, посредством которого IGF1 активирует PKB.

Активность

PDK1 оказалась сходной в экстрактах нестимулированных клеток, выращенных в сыворотке клетках и клетках HeLa, обработанных IGF1 и каликулином А (рис.), Что согласуется с предположениями о том, что PDK1 является конститутивно активным и нацелен на PKB, когда оба белка Киназы привлекаются к плазматической мембране с помощью 3-фосфорилированных липидов инозита, генерируемых PI3-киназой.

Каликулин А не влияет на активность экстрагируемого PDK1. Клетки HeLa, выращенные в сыворотке, инкубировали в течение 3 часов в отсутствие (, сыворотка, ) или в присутствии 200 нМ каликулина A (, сыворотка, + Caly A ), или переносили в бессывороточную среду в течение 3 часов и стимулировали в отсутствие ( без сыворотки ) или присутствие каликулина A ( Caly A ) (200 нМ в течение 3 часов), IGF1 ( IGF1 ) (100 нг / мл в течение 15 минут) или обоих ( Caly A + IGF1 ).Клетки лизировали, PDK1 иммунопреципитировали из лизатов и анализировали. Активности представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3

PI3-киназа активируется в клетках, когда ее регуляторная субъединица связывается с фосфотирозиновыми остатками рецепторов активированного фактора роста или адаптерных белков, таких как белки субстрата инсулинового рецептора (IRS) [43 –45]. Десять лет назад было высказано предположение, что TNFα является медиатором инсулинорезистентности при инфекции, опухолевой кахексии и ожирении за счет фосфорилирования IRS1 по остаткам серина, и это повышенное фосфорилирование серина препятствует индуцированному инсулином фосфорилированию IRS1 тирозина и ухудшает действие инсулина [46]. .В недавних предыдущих работах, посвященных анализу роли серинового фосфорилирования IRS1 в опосредовании инсулинорезистентности, индуцированной жиром, в скелетных мышцах мышей in vivo, мутации IRS1 Ser612 в аланин, защищенного от индуцированной жиром инсулинорезистентности, показана важная роль фосфорилирования IRS1 по Ser612. в механизмах инсулинорезистентности [47]. Таким образом, с целью анализа роли Ser-фосфорилирования IRS1 в процессе, посредством которого каликулин А снижает IGF1-зависимое фосфорилирование Thr308 и активацию PKB, уровни фосфорилирования Ser612 были проанализированы в клетках HeLa, стимулированных каликулином А.Результаты показывают, что каликулин А способствует фосфорилированию Ser612 IRS1 в зависимости от дозы и времени (рис.). Кроме того, фосфорилирование Ser612 IRS1 также было очевидным во время обработки IGF1 в присутствии каликулина A (рис.).

Каликулин А увеличивает фосфорилирование Ser612 IRS1. Клетки HeLa, выращенные в сыворотке, инкубировали с каликулином A (200 нМ) ( Сыворотка + Caly A ) в течение указанного времени ( a ) или в течение 3 часов для указанных концентраций ( c ).Клетки HeLa, перенесенные в бессывороточную среду в течение 3 часов, инкубировали с каликулином A (200 нМ) ( Без сыворотки + Caly A ) в течение указанного времени ( b ) или в течение 3 часов для указанных концентраций ( d ). . Лизаты белков разделяли на 10% гелях SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали указанными антителами. Был проведен денситометрический анализ и выполнено вычисление соотношений фосфо / общее количество различных киназ.

Каликулин A блокирует базальную и стимулированную IGF1 IRS1-ассоциированную PI3-киназу.Клетки HeLa переносили в бессывороточную среду в отсутствие ( Сыворотка ) или в присутствии каликулина A ( Caly A ) (200 нМ в течение 3 часов), IGF1 ( IGF1 ) (100 нг / мл в течение 15 минут. ) или оба ( Caly A + IGF1 ). Клетки лизировали, и IRS1 и связанный с ним белок (-ы) подвергали иммунопреципитации из лизатов и анализировали на активность PI3-киназы. Активности представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3, * P = 0,0016, Студент t -тест).Кроме того, лизаты белков разделяли на 10% SDS-PAGE гелях, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали указанными антителами. Был проведен денситометрический анализ и выполнено вычисление соотношений фосфо / общее количество различных киназ

Стимуляция клеток IGF1 вызвала 32-кратное увеличение активности IRS1-ассоциированной PI3-киназы, которая сильно блокировалась каликулином А (рис.). . Кроме того, каликулин А блокировал базальную активность PI3-киназы, связанную с IRS1.Эти находки с каликулином А согласуются с серин / треониновым фосфорилированием IRS1, предотвращающим рекрутирование PI3-киназы, что было обнаружено при нормальной физиологической регуляции и при болезненных состояниях, таких как инсулинорезистентность (обзор [44, 45]). Например, окадаиновая кислота ингибировала ассоциацию IRS1 и PI3-киназы, стимулированной IGF1 в клетках астроцитомы [43], а TNFα индуцировал серилфосфорилирование IRS1, и этот эффект имитировал окадаиновая кислота и каликулин A [46]. Обнаружение того, что каликулин A блокирует IGF1-индуцированную IRS1-ассоциированную активность PI3-киназы (рис.), вероятно, зависящий от сильного фосфорилирования IRS1 Ser612, вероятно, объясняет, почему фосфорилирование Thr308 и активность PKB в клетках, обработанных IGF1 плюс каликулин A, были не выше, чем наблюдаемые при использовании только каликулина A (фиг.,).

Заключение

Целью данной работы был анализ интересных наблюдений фосфорилирования и активации PKB во время стимуляции ингибитором фосфатазы; во-первых, как сильное фосфорилирование Ser473 PKB с очевидным отсутствием фосфорилирования Thr308 может поддерживать активацию PKB; во-вторых, как каликулин А блокирует IGF1-зависимое фосфорилирование Thr308 и активацию PKB.

Наши данные предполагают, что каликулин А способствует фосфорилированию Ser473 в PKB, поддерживая уровни активации PKB, аналогичные тем, которые обнаруживаются в физиологических условиях в сывороточных клетках, даже при базальных уровнях фосфорилирования Thr308. Эти данные предполагают, что активность PKB больше всего зависит от уровня фосфорилирования Ser473, а не фосфорилирования Thr308, что подтверждает предыдущие сообщения [48]. Тем не менее, наши данные с PDK1 ^{+ / +} и PDK1 ^{— / —} ES клетки мыши предполагают, что базальное фосфорилирование Thr308 необходимо для зависимой от каликулина А активации PKB.Кроме того, наши данные предполагают, что индуцированное каликулином А фосфорилирование Ser473 в значительной степени блокировалось LY294002 и SB-203580, что указывает на то, что как PI3-киназа / TORC2-зависимая, так и SAPK2 / p38-зависимая протеинкиназы способствовали фосфорилированию Ser473 в каликулине A- обработанные клетки.

Кроме того, наши данные предполагают, что фосфорилирование Ser612 IRS1 каликулином A может объяснить, почему стимуляция IGF1 в присутствии каликулина A не способствует активации PI3-киназы, фосфорилированию Thr308 и IGF1-зависимой активации PKB.

Комплексы OX40 с PI3K и PKB для усиления TCR-зависимой передачи сигналов PKB

J Immunol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2012 15 марта.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC3079230

NIHMSID: NIHMS266240

Отдел иммунного регулирования, Институт аллергии и иммунологии Ла-Холья, адрес 92037

, Ла-Джолла, Калифорния запросы на переписку и перепечатку д-ру Майклу Крофту, Институт аллергии и иммунологии Ла-Хойи, 9420 Athena Circle, La Jolla, CA 92037.gro.iail@kcim Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна бесплатно на сайте J Immunol. См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Для активации Т-лимфоцитов требуется сигнал 1 от рецептора Т-клеток (TCR) и сигнал 2 от костимулирующих рецепторов. Для длительного иммунитета важны сигналы роста и выживания, передаваемые через путь Akt / PKB в активированных или эффекторных Т-клетках, и на них может сильно влиять передача сигналов от OX40 (CD134), члена суперсемейства TNFR.В отсутствие OX40 Т-клетки не расширяются эффективно до антигена, и формирование памяти нарушается. Как большинство костимулирующих рецепторов интегрируют свои сигналы с сигналами от антигена через TCR, неясно, включая то, рекрутирует ли OX40 напрямую PKB или молекулы, которые регулируют PKB. Мы показываем, что OX40 после лигирования с помощью OX40L собирает сигнальный комплекс, который содержит адаптер TRAF2, а также PKB и его активатор PI-3-киназу выше по течению. Рекрутирование PKB и PI3K зависело от TRAF2 и от транслокации OX40 в нерастворимые в детергенте липидные микродомены мембран, но не зависело от вовлечения TCR.Однако OX40 приводил к сильному фосфорилированию и функциональной активации пути PI3K / PKB только при распознавании антигена. Следовательно, OX40 в первую очередь функционирует для усиления передачи сигналов PKB в Т-клетках путем увеличения количества PI3K и PKB, доступных для TCR. Это подчеркивает количественную роль второго сигнала этого семейства TNFR в дополнении сигнала 1.

Введение

Активация Т-клеток инициируется распознаванием комплексов гистосовместимости пептидов (MHC) и взаимодействием костимулирующих рецепторов с их лигандами, присутствующими на поверхности. антигенпрезентирующих клеток (АПК) (1).Распознавание Т-клеточного антигена сопровождается активацией фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и устойчивым повышением уровня липидного вторичного мессенджера фосфатидилинозитол (3,4,5) трифосфата (PIP ₃ ). Локализация PIP ₃ на внутренней створке плазматической мембраны Т-клеток привлекает домен гомологии плекстрина (PH), содержащий сигнальные молекулы, такие как Akt, известную также как протеинкиназа B (PKB) (2–4). PKB фосфорилируется по треонину 308 и серину 473, что приводит к его полностью активной форме.Это может способствовать нескольким клеточным ответам, включая контроль роста, вступления в клеточный цикл, выживания и метаболизма глюкозы. Таким образом, ось PI3K-PKB важна для клональной экспансии, дифференцировки и долголетия Т-клеток (5-8).

Было описано несколько костимулирующих рецепторов в суперсемействе Ig, непосредственно нацеленных на PI3K и приводящих к активации PKB. Первая и наиболее охарактеризованная костимулирующая молекула, CD28, которая конститутивно экспрессируется на Т-клетках, напрямую рекрутирует регуляторную субъединицу p85α PI3K через мотив pYMNM, расположенный в цитоплазматическом хвосте (9, 10).Мутационный анализ CD28 путем замены тирозина в мотиве YMNM на фенилаланин показал, что ось CD28-PI3K передает сигналы выживания, но не является необходимым для продукции IL-2 или пролиферации (11-13). Индуцибельный костимулятор (ICOS, CD278), который не является конститутивным для Т-клеток, но экспрессируется на активированных эффекторных Т-клетках, также рекрутирует p85α и p50α PI3K через мотив pYMFM (14, 15). Мутационный анализ в цитоплазматическом хвосте путем замены тирозина на фенилаланин показал, что ось ICOS-PI3K контролирует продукцию IL-4 и IL-21, что имеет решающее значение для дифференцировки фолликулярных Т-хелперных Т-клеток и гуморального иммунитета (16, 17).

Молекула семейства TNFR OX40 (CD134), которая индуцируется на Т-клетке после распознавания антигена, также может регулировать общий уровень активности PI3K-PKB в Т-клетке. CD4 T-клетки, лишенные OX40, не поддерживали активность PI3K и передачу сигналов PKB с течением времени после встречи с антигеном, что коррелировало с нарушением размножения и выживаемости эффекторных клеток и плохой генерацией памяти Т-клеток (18, 19). Более того, фенотип, проявляемый OX40-дефицитными Т-клетками, включал дефектную экспрессию Bcl-xL, Bcl-2, Bfl-1 и сурвивина, и это было устранено введением конститутивно активной формы PKB в антиген-отвечающий OX40- / — Т-клетки (18, 19).Однако, в отличие от CD28 и ICOS, OX40 не имеет консенсусного мотива YXXM в своем цитоплазматическом хвосте, который мог бы рекрутировать PI3K. Поэтому неясно, как OX40 регулирует путь PI3K-PKB и является ли активность, проявляемая OX40, прямой.

Здесь мы показываем, что взаимодействие OX40L, экспрессируемого на APC, приводит к перемещению OX40 в нерастворимые в детергенте микродомены мембранных липидов (DIM), богатые холестерином и сфинголипидами, и сборку сигнального комплекса, содержащего TRAF2, PKB и Субъединица p85 PI3K.Ассоциации PKB и p85 / PI3K с OX40 предшествовало рекрутирование TRAF2, и она зависела от TRAF2 и движения в DIM. Однако комплекс, содержащий p85 / PI3K и PKB, не зависел от распознавания TCR или антигена. Напротив, сигнаносома OX40 только увеличивала общее клеточное фосфорилирование PKB и активность PKB при представлении антигена. Таким образом, OX40 может рекрутировать PI3K и PKB, но он регулирует активацию за счет обычной роли истинного сопутствующего сигнала, количественно усиливая инициируемый TCR сигнал 1.

Материалы и методы

Клетки и конструкции

Т-клетки CD4 из AND (Tg (TcrAND) 53Hed) x ox40 — / — ( tnfsf4 — / — ) TCR-трансгенных мышей (Vβ3 / Vα11) на B10.BR- h3k h3-T18a / SgSnJ были активированы пептидом цитохрома c (MCC) моли (MCC _88-103 ) и первичными эффекторными Т-клетками, слитыми с линией клеток тимомы, BW5147, с использованием полиэтиленгликоля. Был выбран репрезентативный клон, продуцирующий IL-2. N-концевой cMyc-меченный мышиной OX40 субклонировали в вектор pEF1 (Invitrogen).Клетки Т-гибридомы трансфицировали контролем или вектором cMyc-OX40 и отбирали с помощью G418 (Invitrogen). Вектор MSCV-LTRmiR30-PIG (LMP) (Open Biosystems), содержащий адаптированную к микро-РНК короткую шпилечную РНК (shRNAmir) против мышиного TRAF2, был предоставлен доктором Хидеки Санджо (20). Производство ретровирусов было таким, как описано (19). Клеточная линия фибробластов DCEK, экспрессирующая эндогенный CD80, была трансфицирована I-E ^k и OX40L (21). Т-клетки (5 × 10 ⁵ клеток на мл) стимулировали клетками DCEK (1.От 5 до 10 × 10 ⁵ клеток на мл) и различных концентраций T102S, суперагонистического пептида MCC. Обычно использовали 10 мкМ пептида. Для истощения DIM Т-клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями разрушающего холестерин лекарственного средства метил-β-циклодекстрина (MβCD) в течение 1 часа. Ингибирование биосинтеза сфинголипидов и холестерина осуществляли (22) путем культивирования в полной среде, содержащей сыворотку, в течение 48 часов в присутствии 25 мкМ мириоцина, а затем голодали по сыворотке в течение 14 часов в присутствии 5 мкМ Сарагозиновой кислоты и 25 мкМ мириоцина.

Пептиды, химические вещества и антитела

T102S (аминокислоты 88-103; ANERADLIAYLKQASK) был синтезирован Abgent (Сан-Диего). LY294002 (# 440202) был от Calbiochem. Сахароза (# 84097), метил-β-циклодекстрин (MβCD, C4555), конъюгированный с пероксидазой холерный токсин B (CT-HRP, C3741), мириоцин (M1177) и зарагозовая кислота (Z2626) были от Sigma. Anti-cMyc (R950-25) и Dynabeads ^® Protein G (100.04D) были от Invitrogen. Brij-58 (№ 28336), Nonidet P-40 (№ 28324) и н-додецил-β-мальтозид (№ 89903) были от Thermo Scientific.Сефароза протеина G (17-0618-01) была получена от GE Healthcare. Анти-CD80 (16-10A1, # 104710) и -OX40 (OX86, # 119408) были от Biolegend. Anti-cMyc (9B11, # 2233 и # 2276), -p-Erk (# 9101), -p-PI3 киназа p85 (Tyr458, # 4228), -PI3 киназа p85 (# 4257), -p-PKB (Ser473 , # 9271), -p-PKB (Thr308, # 4056) и -PKB (# 9272) были от Cell Signaling Technology. Антиактин (C4, MAB1501), -фосфотирозин (4G10 ^® , 05-321) и -LAT (06-807) были от Millipore. Анти-TRAF2 (592) и -TRAF2 (M112-3) были из MBL.Анти-PDK1 (ab31406) был от abcam. Anti-OX40 (AF1256) был от R&D systems. Anti-Erk (K-23, sc-94) был от Santa Cruz Biotech.

Продукция IL-2

IL-2 измеряли с помощью ELISA с антителами JES6-1A12 (# 554424) и биотин-JES6-5h5 (# 554426) от BD PharMingen.

Вестерн-блоттинг

Для общих лизатов клетки лизировали в ледяном буфере RIPA (20 мМ трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1% Nonidet P-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, 50 мМ NaF, 1 мМ Na ₃ VO ₄ ), содержащий коктейль ингибиторов протеазы (Sigma, P8340) в течение 15 мин.После перемешивания при 4 ° C в течение 60 минут нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 13000 об / мин в течение 10 минут. Содержание белка определяли с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (Thermo Scientific). Равные количества (5–20 мкг) растворяли в буфере для образцов LDS (NP0007, Invitrogen), содержащем DTT (NP0004, Invitrogen), и восстанавливали при 70 ° C в течение 10 мин. Образцы загружали в 4–12% гели NuPage Bis-Tris (SDS-PAGE), переносили на мембрану PVDF (Invitrogen) и проводили иммуноблоттинг. Все блоты проявляли с использованием субстрата Immobilon western HRP (Millipore).

PIP

₃ измерение

Количество PIP ₃ было измерено с помощью набора PIP ₃ mass ELISA (Echelon, K-2500s) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, Т-клетки cMyc-OX40 (1 × 10 ⁷ клеток) стимулировали клетками DCEK (3 × 10 ⁶ клеток) в присутствии (50 мкМ) или в отсутствие пептида MCC в течение 15 мин. Клетки промывали 0,5 М трихлоруксусной кислотой (TCA), а затем 5% TCA, содержащей 1 мМ EDTA. Нейтральные липиды сначала были исключены из осадка клеток с помощью MeOH: CHCl ₃ (2: 1).Кислые липиды затем экстрагировали 2,25 мл MeOH: CHCl ₃ : 12 М HCl (80: 40: 1) и разделяли центрифугированием после добавления 0,75 мл CHCl ₃ и 1,35 мл 0,1 М HCl. Нижнюю фазу сушили в вакууме и растворяли в буфере PIP ₃ . Контроли, стандарты и образцы инкубировали последовательно с детектором PIP ₃ , вторичным реагентом обнаружения и раствором TMB. Реакцию останавливали добавлением стоп-раствора (0,5 М H ₂ SO ₄ ) и измеряли оптическую плотность при 450 нм.

Выделение DIM

Для ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы клетки лизировали в 1 мл 1% буфера для лизиса Brij-58 (50 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 25 мМ KCl, 5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF, 1 мМ Na ₃ VO ₄ ), содержащий коктейль ингибиторов протеазы, в течение 30 мин. Клетки разрушали пассажами (10 ×) через иглу 22 размера в шприце на 1 мл. Лизаты центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин при 4 ° C и супернатанты смешивали с 1 мл 80% мас. / Об. Сахарозы в том же буфере для лизиса и покрывали 2 мл 30% сахарозы, а затем 1 мл 5% сахарозы.Образцы ультрацентрифугировали в роторе Beckman SW50Ti при 200000 g в течение 16 часов при 4 ° C. Двенадцать фракций (0,4 мл / фракция) собирали с вершины градиента. Для визуализации GM1 фракции подвергали дот-блоттингу на нитроцеллюлозной мембране и детектировали с помощью CT-HRP. Белки из каждой фракции осаждали трихлоруксусной кислотой (TCA) перед иммуноблоттингом.

В качестве альтернативы фракции DIM получали двухстадийным методом разделения. Были приготовлены постнуклеарные лизаты в 1% буфере для лизиса Brij-58 и ультрацентрифугированы при 100000 g в течение 50 минут при 4 ° C.Осадки клеток собирали и растворяли в 1% SDS, содержащем ледяной буфер RIPA. После перемешивания в течение 60 минут при 4 ° C супернатанты, содержащие экстрагированные белки DIM, собирали центрифугированием при 13000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C.

Иммунопреципитация

Клетки лизировали ледяным RIPA или 1% н-додецил-β-мальтозидом в течение 30 мин. Клетки разрушали пропусканием (30 ×) через иглу 22 размера в шприце на 1 мл. Лизаты центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут при 4 ° C для удаления нерастворимого материала с последующей предварительной очисткой шариками сефарозы с протеином G в течение 30 минут при 4 ° C.Лизаты подвергали иммунопреципитации первичными Abs, cMyc (9B11) и TRAF2 (M112-3) и шариками с протеином G при 4 ° C в течение ночи. После отмывки RIPA или 1% н-додецил-β-мальтозида шарики инкубировали при 70 ° C в 4-кратном буфере для образцов LDS в течение 10 мин. После сбора IP-лизатов из шариков и разбавления ультрачистой водой эти образцы в 2 × буфере LDS были дополнительно восстановлены с помощью DTT при 70 ° C в течение 10 минут для иммуноблоттинга.

Результаты

Совместный сигнал OX40 поддерживает TCR-зависимую активацию PKB

Используя OX40-дефицитные TCR-трансгенные Т-клеточные системы, мы ранее продемонстрировали на антиген-отвечающих эффекторных Т-клетках, что OX40 необходим для оптимальной активации PI3K / PKB Этот путь скоординированно регулирует пролиферацию Т-клеток, выживаемость и секрецию цитокинов (18).Чтобы понять, как OX40 регулирует PI3K / PKB, мы создали MCC-пептид-специфичную Т-клеточную гибридому, полученную из эффекторных Т-клеток, полученных от трансгенных мышей с дефицитом OX40 и Vα11 / Vβ3 TCR. Затем эти Т-клетки трансфецировали конструкцией cMyc-OX40, чтобы позволить OX40 эффективно иммунопреципитировать через тег Myc.

Т-клетки стимулировали APC фибробласта, который экспрессирует B7 (CD80) и OX40L и может представлять пептид MCC на I-E ^k (21). Без антигена Т-клетки не продуцируют IL-2 даже в присутствии взаимодействий OX40-OX40L и CD28-CD80 ().Лигирование OX40 сильно стимулировало IL-2 при представлении антигена. Некоторые из них были независимыми, а часть зависела от CD28, что проявлялось в блокировании CD80. Напротив, сигналы антигена и CD28 приводили только к умеренной продукции IL-2 (). В линиях Т-клеток человека Jurkat продукция IL-2, индуцированная TCR и CD28, нечувствительна к ингибиторам PI3K вортманнину и LY294002, отчасти из-за потери экспрессии PTEN (гомолог фосфатазы и тензина) (23-25). В нашей мышиной Т-клеточной гибридоме LY294002 подавлял антиген и OX40L-зависимую продукцию IL-2 дозозависимым образом (), что указывает на активность PI3K.В соответствии с этим, когда субъединица p85 PI3K была иммунопреципитирована после стимуляции антигеном и OX40L от APC, мы обнаружили, что она сильно фосфорилирована тирозином (). Кроме того, PIP ₃ был повышен в Т-клетках, стимулированных антигеном / OX40L ().

OX40 способствует антиген-зависимой активации PKB

(A) Продукция IL-2 из контрольного вектора OX40 — / — (открытый символ) и cMyc-OX40 (закрытый символ) трансдуцированных клеток гибридомы AND T, оцениваемых в присутствии или в отсутствие указанные концентрации пептида MCC и B7 + OX40L + DCEK APC, а также блокирующего антитела против CD80 (10 мкг / мл, квадрат) через 24 часа.(B) IL-2 из Т-клеток, экспрессирующих cMyc-OX40, стимулированных антигеном и APC в присутствии указанных концентраций LY294002 в течение 4 часов. Данные в A и B представляют собой средние значения с SD для трех культур. (C и D) Т-клетки cMyc-OX40 стимулировали APC в присутствии или в отсутствие антигена в течение 1 часа (C) или 15 минут (D). (C) p85 подвергали иммунопреципитации, и образцы анализировали на указанные белки. (D) PIP ₃ был извлечен из клеток и количественно определен, как описано в материалах и методах.Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Стьюдента t (*, p <0,01). (E и F) Уровни экспрессии белка оценивали с помощью иммуноблоттинга общих лизатов Т-клеточных гибридомных клеток (E) и первичных wt или OX40 - / - И эффекторных Т-клеток CD4 (F), культивированных с пептидом и APC в течение 0–90 минут. (G) Т-гибридомные клетки стимулировали антигеном и APC в присутствии или в отсутствие 10 мкМ LY294002, и общие лизаты анализировали на указанные белки. (H) Т-гибридомные клетки стимулировали APC в присутствии или в отсутствие антигена в течение 1 часа и оценивали уровни цитозольного белка.Денситометрию выполняли с помощью программного обеспечения YabGelImageX1.2, используя 1 в качестве эталона наивысшего уровня. Все результаты репрезентативны как минимум для двух экспериментов.

Во время начальной активации Т-клеток в присутствии антигена фосфорилирование PKB (T308 и S473) и p85 (Y458) индуцировалось в OX40-дефицитных клетках (контрольный вектор), но эти активности сильно усиливались и поддерживались в более позднее время за счет взаимодействие OX40 с OX40L (Т-клетки cMyc-OX40) (). Подобно нашим предыдущим результатам (18), когда первичные эффекторные Т-клетки CD4 стимулировались антигеном, фосфорилирование T308 и S473 на PKB было серьезно нарушено с течением времени в отсутствие OX40 (), показывая, что эндогенный OX40 обеспечивает те же сигналы, что и трансфицированный OX40. в клетках гибридомы.В соответствии с данными в, LY294002 полностью ингибировал фосфорилирование PKB, опосредованное антигеном и OX40L в гибридоме (). Таким образом, PI3K контролирует активацию PKB, а OX40 вносит значительный вклад в активацию этого пути PI3K / PKB при распознавании антигена.

Чтобы решить роль TCR, клетки стимулировали без антигена. Взаимодействия OX40 / OX40L сами по себе не могут индуцировать эффективное фосфорилирование PI3K и PKB (соответственно). Это указывает на то, что OX40 способствует TCR-зависимой активации PI3K и, как следствие, фосфорилированию PKB.Фосфорилирование Erk явно индуцировалось антигеном, но на него не влияли сигналы OX40, что демонстрирует некоторую селективность (). Следовательно, OX40 представляет собой доминирующий стимул для продвижения оси PI3K-PKB в эффекторных Т-клетках, но делает это только в качестве совместного сигнала для увеличения активности, индуцированной антигеном / TCR.

OX40 рекрутирует TRAF2, PI3K и PKB

Чтобы понять, как OX40 усиливает TCR-зависимую активацию PKB, OX40 иммунопреципитировали с помощью тега cMyc, а связанные белки исследовали с помощью иммуноблоттинга.Было показано, что адаптерный белок TRAF2 ассоциируется с OX40 (26, 27). Перед стимуляцией OX40L, экспрессируемой на APC, OX40 не взаимодействовал заметно с TRAF2 или другими сигнальными молекулами. После стимуляции OX40L, OX40 сильно ассоциировался с эндогенно экспрессируемым TRAF2 (). Более того, в этом иммунопреципитате были обнаружены p85 и PKB (). В культурах, где контакт T-APC не был принудительным и, вероятно, увеличивался с течением времени, наблюдалось длительное комплексообразование (), однако 10-минутной стимуляции было достаточно для обнаружения комплекса ().Более того, это не зависело от вовлечения TCR, происходящего независимо от презентации пептида (). Комплекс также индуцировали агонистическим антителом к ​​OX40 в отсутствие APC (). Мы оценили любое возможное привлечение TCR, CD3 или CD28, но не смогли обнаружить эти молекулы и обнаружить проксимальные киназы, Zap70, Lck или SLP-76 в иммунопреципитатах (данные не показаны), что позволяет предположить, что OX40 образует уникальный Сигналосома отделена от сигнаносом TCR и CD28.

OX40 рекрутирует PI3K, PKB и PDK1, независимо от антигена

(A – E) cMyc-OX40 или контрольный вектор Т-клетки стимулировали B7 + OX40L + APC, с антигеном или без него, как в (A – C и E) или стимулировались агонистическим антителом против OX40 (D).Клетки лизировали в буфере RIPA, содержащем NP-40 (A – E), или в додецилмальтозиде (E), и OX40 подвергали иммунопреципитации. Образцы анализировали на указанные белки через 0–3 часа (A), 3 часа (B, D и E) или 10 минут (C). Звездочка в E показывает полосы H-цепи. (F) Т-клетки cMyc-OX40 стимулировали APC с антигеном или без него в течение 1 часа и лизаты иммунопреципитировали с помощью mAb стыковочного мотива антифосфосерин / треонин-PDK1. Bef. Стим. представляет собой OX40, иммунопреципитированный из нестимулированных Т-клеток. Все результаты репрезентативны как минимум для двух экспериментов.

Интересно, что низкий уровень фосфорилированного p85 и PKB, фосфорилированного серином, но не треонином, был обнаружен в сигнаносоме OX40, и снова это также было антиген-независимым (). Активация PI3K вызывает перемещение фосфоинозитид-зависимой киназы 1 (PDK1) в обогащенную фосфолипидами плазматическую мембрану. PDK1 активируется на мембране и фосфорилирует субстратные киназы, такие как PKB. Затем мы исследовали, был ли PDK1 задействован в OX40. Мы не обнаружили PDK1 в стандартных условиях IP с использованием RIPA, но при использовании н-додецил-β-мальтозида, детергента, который сохраняет структуру мембранного белка, мы обнаружили низкий уровень PDK1 (полосы 58–68 кДа), осаждавшегося после OX40 лигировали с помощью OX40L ().Опять же, это не зависело от участия TCR (). Это означает, что небольшое количество фосфорилированной PKB, присутствующей в антиген-независимом сигнальном комплексе OX40, вероятно, связано с этим незначительным количеством рекрутированного PDK1. Мы также иммунопреципитировали PDK1, но не смогли обнаружить OX40 (данные не показаны), также предполагая, что количество общего клеточного PDK1, которое образует комплексы с OX40, невелико. Как было показано ранее, большая часть общего клеточного фосфорилированного p85 и фосфорилированного серином и треонином PKB зависела от распознавания антигена ().Это также подразумевает, что PDK1, который может способствовать этой активности, в первую очередь задействован посредством передачи сигналов TCR, предполагая, что роль OX40 состоит в рекрутировании как PI3K, так и PKB и обеспечения их доступности для дальнейшего или непрерывного фосфорилирования, когда задействован TCR. Чтобы сопоставить это с активностью PDK1, лизаты Т-клеток были приготовлены до и после стимуляции антигеном / OX40L, и белки были иммунопреципитированы с помощью mAb, специфичных для фосфорилированных пептидных последовательностей субстрата PDK1 (стыковочные мотивы PDK1).Как показано на верхней панели, стимуляция антигеном / OX40L индуцировала сильное фосфорилирование в цитоплазматическом белке ~ 60 кДа, но без сигнала антигена это было незначительным. Было обнаружено, что белок представляет собой PKB (средняя панель). Таким образом, лигирование OX40 с помощью OX40L в контексте презентации антигена, вероятно, обеспечивает повышенное количество PKB, на которое затем может нацеливаться активность PDK1, которая в первую очередь является результатом вовлечения TCR.

TRAF2 играет критическую роль для активации PKB с помощью OX40

Важный вопрос заключается в том, как OX40 рекрутирует PKB.Путем иммунопреципитации TRAF2 мы обнаружили, что и OX40, и PKB разрушались, но только после взаимодействия OX40-OX40L (). Это коррелирует с некоторыми исследованиями, которые предположили, что определенные члены адаптерных белков семейства TRAF могут прямо или косвенно взаимодействовать с PKB (1, 29). Чтобы исследовать функциональное значение TRAF2 для сигнаносомы, экспрессию снижали обработкой shРНК в Т-клетках cMyc-OX40. Наблюдалась потеря примерно 70% TRAF2, но экспрессия OX40 и cMyc не изменилась ().Подавление экспрессии TRAF2 блокировало продукцию IL-2 в ответ на антиген, представленный на B7 / OX40L APC, почти до уровня, секретируемого OX40-отрицательными Т-клетками (). Параллельно активация общего клеточного PKB нарушалась после стимуляции антигеном и OX40L (). Соответственно, ассоциация OX40 с PKB была сильно снижена, когда TRAF2 был нокдаун (). В отличие от CD28 и ICOS, OX40 не содержит консенсусных фосфотирозиновых мотивов в цитоплазматическом хвосте для взаимодействия с PI3K (28). Интересно, что ассоциация OX40 с p85 также сильно снижается, когда TRAF2 нокдаун (), указывая тем самым, что TRAF2 прямо или косвенно играет ключевую роль в привлечении PI3K, а также PKB.

TRAF2 имеет решающее значение для активации PKB, опосредованной OX40

(A) cMyc-OX40 Т-клетки стимулировали APC без антигена в течение 0–2 часов, а TRAF2 подвергался иммунопреципитации для анализа связанных белков. (B) cMyc-OX40 или контрольные (OX40 — / -) Т-клетки трансдуцировали shTRAF2 или контрольной shRNA, и уровни IL-2 определяли через 24 часа после стимуляции различными дозами антигена / APC. (C) Фосфорилирование PKB оценивали через 0–90 минут после стимуляции антигеном Т-клеток, трансдуцированных, как в B.(D) Белки, коиммунопреципитированные с cMyc-OX40, визуализировали с помощью иммуноблоттинга в shTRAF2 или контрольных трансдуцированных shRNA Т-клетках перед стимуляцией (0 час) или через 1 час после стимуляции антигеном / APC. Результаты репрезентативны как минимум для двух экспериментов.

Нерастворимые в детергенте липидные микродомены необходимы для активации PKB

Важным этапом активации PKB является его перемещение из цитозоля на плазматическую мембрану. Затем мы сосредоточились на микродоменах нерастворимых липидов в детергентах (DIM), которые могут быть необходимы для эффективной внутриклеточной передачи сигналов (22, 30).Стимулированные антигеном / APC Т-клетки cMyc-OX40 лизировали в буфере, содержащем Brij-58, слабый неионогенный детергент, который сохраняет DIM, и анализировали после ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы. Активация антигеном / OX40L индуцировала сильную транслокацию OX40 в DIM (). Первоначально уровни снизились до ~ 60% от начального уровня в течение 1 часа, а затем увеличились до ~ 300% через 3-4 часа (данные не показаны). Переход OX40 в DIM сопровождался TRAF2 (). Часть p85, PKB и PDK1 экспрессировалась в DIM до и после стимуляции Т-клеток, что позволяет предположить, что эти молекулы были доступны для OX40, который переместился в этот компартмент.Важно отметить, что OX40, который перемещается в DIM, ассоциированный с TRAF2, p85 и PKB (), подразумевает, что среда DIM важна для инициации пути PI3K / PKB. После стимуляции фракции DIM, выделенные из нерастворимых в Brij-58 осадка Т-клеток cMyc-OX40, содержали фосфорилированный PKB, но это зависело от распознавания антигена и не наблюдалось после взаимодействия с OX40L в отсутствие антигена (и данные не показаны). Эти результаты предполагают, что OX40 может рекрутировать PKB в свой сигнальный комплекс в DIM, что затем позволяет PKB быть доступным для фосфорилирования, запускаемого событиями передачи сигналов, связанных с TCR.

Транслокация OX40 в DIM связана с активацией PKB.

(A и B) cMyc-OX40 Т-клетки стимулировали APC в присутствии антигена в течение 3 часов. (A) Фракции из градиента сахарозы лизатов нестимулированных (0 ч) и стимулированных Т-клеток были подвергнуты иммуноблоттингу. LAT и GM1 являются маркерами DIM. CD71 (рецептор трансферрина) представляет собой маркер, не относящийся к DIM. (B) OX40 иммунопреципитировали из объединенных фракций № 1–5 в A. (C) Контрольный вектор и Т-клетки cMyc-OX40 стимулировали APC в присутствии антигена в течение 30 мин, как в A.Фракции DIM и не-DIM (растворимые) получали с помощью метода двухэтапного разделения, а уровни белка оценивали с помощью иммуноблоттинга. Результаты репрезентативны как минимум для двух экспериментов.

Для исследования важности окружения микродомена мембраны использовали препарат, разрушающий холестерин, метил-β-циклодекстрин (MβCD). Истощение холестерина полностью блокировало антиген и OX40L-зависимую продукцию IL-2 () и, коррелируя с этим, сильно ингибировало фосфорилирование PKB ().Подавление синтеза сфинголипидов и холестерина ингибиторами мириоцина (M) и зарагозовой кислотой (Z), соответственно, которые также вызывают нарушение DIM, аналогичным образом приводило к нарушению фосфорилирования PKB (2). Важно отметить, что ассоциация OX40 с TRAF2 не изменилась после разрушения DIM, тогда как ассоциация с p85 и PKB была по существу отменена (). Таким образом, OX40 рекрутирует TRAF2 вне DIM, а затем p85 и PKB рекрутируются в DIM-резидентный комплекс OX40-TRAF2. Таким образом, DIM служит важной платформой для интеграции OX40 с TCR для усиления последующей активации PKB.

Нарушение DIM блокирует рекрутирование PI3K и PKB в OX40 и ингибирует активацию PKB.

(A) Т-клетки cMyc-OX40 предварительно обрабатывали 10 мМ MβCD. Уровни IL-2 измеряли через 4 часа в Т-клетках, стимулированных APC и различными концентрациями антигена. (B) Т-клетки cMyc-OX40, обработанные различными концентрациями MβCD, культивировали с антигеном и APC в течение 1 часа, и уровни белка PKB оценивали с помощью иммуноблоттинга. Bef. Стим. представляет собой нестимулированные Т-клетки. (C) Т-клетки cMyc-OX40, обработанные MZ, культивировали с антигеном и APC в течение 0 и 1 часа и оценивали уровни белка.(D) Т-клетки cMyc-OX40, предварительно обработанные в присутствии или в отсутствие 10 мМ MβCD, культивировали с APC в отсутствие антигена в течение 1 часа. cMyc-OX40 был иммунопреципитирован из общих клеточных лизатов и проанализированных связанных белков. Bef. Stim представляет собой OX40, осажденный из нестимулированных Т-клеток. Результаты репрезентативны как минимум для двух экспериментов.

Discussion

В этом исследовании мы показали, что член семейства TNFR OX40 формирует сигнальный комплекс, который содержит PI3K и PKB. Рекрутирование этих молекул зависит от TRAF2 и происходит в нерастворимых в детергенте мембранных липидных микродоменах после того, как OX40 и TRAF2 перемещаются в этот клеточный компартмент, управляемый лигированием OX40 с помощью OX40L.Мы показываем, что это ключевое событие, которое сильно усиливает антиген / TCR-зависимую активацию пути PI3K-PKB.

Физиологические взаимодействия между Т-клетками и антиген-несущими APC способствуют увеличению PIP ₃ во внутренней мембране Т-клеток в течение многих часов (2, 3). Известно, что после сшивки TCR PI3K генерирует PIP ₃ посредством фосфорилирования PI4,5-бифосфата (PIP ₂ ). Домен PH PKB распознает PIP ₃ , запуская рекрутирование PKB из цитозоля на плазматическую мембрану.Затем PKB может подвергаться фосфорилированию Thr308 и Ser473 в процессе, который до конца не изучен, но предполагается, что он включает PDK-1 и вторую киназу, называемую PDK-2. Было высказано предположение, что PDK-2 является мишенью для рапамицинового комплекса 2 (mTORC2) у млекопитающих (22, 31). Два события фосфорилирования PKB способствуют его высвобождению в цитозоль, тем самым позволяя фосфорилирование нижестоящих мишеней, из которых существует много возможных, включая GSK3, FoxO1, TSC, IKKα и Bad.

Хотя сигнал 1 от TCR является критическим для продукции PIP ₃ и активации киназ в ранние моменты времени, неясно, как активация киназ максимизируется или сохраняется в течение длительных периодов.В течение многих лет было известно, что CD28 распространяется в DIM (32–34), и недавние исследования показали, что лигирование нескольких рецепторов, включая CD28, приводит к накоплению PIP ₃ в плазматической мембране и образованию функциональных горячих точек в ней. были названы «нанодомены рафта», которые концентрируют PKB в областях DIM и обеспечивают длительную активацию пути PI3K-PKB (22). Кроме того, результаты Сайто и Дэвиса продемонстрировали, что инициируемая TCR передача сигналов происходит в «микрокластерах» или «островках» в плазматической мембране, и такие пространственно и временно регулируемые белковые структуры имеют решающее значение для активации Т-клеток (35, 36).Было обнаружено, что эти микрокластеры или островки либо преобразуются, либо индуцируются лигированием TCR и содержат TCR и несколько киназ и адаптеров, а именно Zap70, SLP-76 и LAT. Было также показано, что после распознавания антигена они временно связываются или агрегируются. В совокупности эти результаты подтверждают гипотезу о том, что сигнал 2 от костимулирующих рецепторов может поддерживать сигнал 1, рекрутируя или поддерживая высокую концентрацию PI3K и PKB вблизи TCR, который находится в этих микрокластерах или нанодоменах мембраны после распознавания пептида.Наши предыдущие результаты (18) в сочетании с нашими текущими результатами также могут быть интерпретированы в этой модели. Мы продемонстрировали, что сигналы OX40 в присутствии антигена увеличивают и продлевают активацию PKB DIM-зависимым образом, и что OX40 связывается в комплекс как с PI3K, так и с PKB. Однако OX40 не оказал заметного или сильного влияния на общее количество PI3K или PKB в DIM. Следовательно, вероятно, что OX40 действует в очень специфических областях DIM, и основная роль OX40 состоит в том, чтобы способствовать высококонцентрированным депо этих молекул либо в микрокластерах / нанодоменах TCR, либо вблизи них.Хотя это необходимо изучить в будущем, OX40 может, таким образом, увеличить количество PI3K и PKB, доступных для этих устройств.

Несколько других членов семейства TNFR могут активировать путь PI3K-PKB. Однако проксимальные этапы, которые используются TNFR для рекрутирования или приводить к активации PI3K или PKB, могут различаться и до конца не изучены. RANK (CD265) после связывания RANKL (CD254), как было описано, активирует PKB посредством рекрутирования TRAF6, Cbl-b и PI3K в комплекс по механизму, зависящему от киназной активности c-Src (37, 38).CD40 индуцирует рекрутирование PI3K и c-Cbl (38), а дефицит Cbl-b, c-Cbl и TRAF6 отменяет CD40L-зависимое фосфорилирование PKB (38, 39). TNF также может активировать PI3K и PKB (40, 41). TNFR1 конститутивно образует комплекс с PI3K, c-Src и Jak2, и было обнаружено, что тирозинкиназная активность как c-Src, так и Jak2 важна для активации пути PI3K-PKB (41). Кроме того, было показано, что TRAILR взаимодействует с c-Src, c-Cbl и PI3K, причем снова активность c-Src является критической для TRAILR-зависимой активации PI3K и PKB (42, 43).Наше исследование показывает, что OX40 рекрутирует PI3K и PKB способом, зависящим от TRAF2, но неясно, взаимодействует ли TRAF2 напрямую с этими молекулами. c-Src, по-видимому, является общим для вышеупомянутых рецепторов, но нам не удалось обнаружить c-Src в сигнаносоме OX40. Критическими регуляторами активации PI3K-PKB после вовлечения семейства TNFR в Т-клетки могут быть ubiquitin ligases из семейства TRAF, а также Cbl. Недавно сообщалось, что PKB подвергается лизин (K) 63-связанному убиквитинированию по K8 и K14 в пределах своего домена PH с помощью TRAF6, и это может регулировать рекрутирование и фосфорилирование PKB мембраны (29).Мы не обнаружили TRAF6 в сигнальном комплексе OX40, но взаимодействие OX40L с OX40 привело к убиквитинированию OX40, которое также было чувствительно к лечению MβCD (неопубликованные результаты), предполагая, что это DIM-зависимое событие убиквитинирования может также играть функциональную роль в усилении молекулярная ассоциация OX40 с p85 и PKB. Затем необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы понять роль убиквитинирования и могут ли другие молекулы связываться с сигнаносомой OX40 внутри DIM, чтобы обеспечить рекрутирование и активацию PI3K и PKB.

Таким образом, наши результаты проливают свет на механизм, с помощью которого костимулирующий рецептор Т-клеток OX40 способствует активации PKB. Эти данные дополняют наши знания о молекулярных механизмах, с помощью которых лигирование OX40 усиливает активацию Т-клеток, управляемую TCR, и предоставляют дополнительную информацию, которая частично объясняет, почему OX40 является важным регулятором эффекторных Т-клеток.

Благодарности

Мы благодарим доктора Jianxun Song и доктора Hideki Sanjo за конструкции ДНК. Это рукопись № 1302 Института аллергии и иммунологии Ла-Хойя.

Работа была поддержана грантами NIH AI49453 и CA M.C.

Ссылки

2. Костелло П.С., Галлахер М., Кантрелл Д.А. Устойчивый и динамичный метаболизм липидов инозита внутри и вне иммунологического синапса. Nat Immunol. 2002; 3: 1082–1089. [PubMed] [Google Scholar] 3. Харриаг Дж., Висмут Г. Визуализация антиген-индуцированной активации PI3K в Т-клетках. Nat Immunol. 2002; 3: 1090–1096. [PubMed] [Google Scholar] 4. Huppa JB, Gleimer M, Sumen C, Davis MM. Непрерывная передача сигналов Т-клеточного рецептора необходима для поддержания синапсов и полного эффекторного потенциала.Nat Immunol. 2003. 4: 749–755. [PubMed] [Google Scholar] 5. Чан Т.О., Rittenhouse SE, Цихлис П.Н. AKT / PKB и другие киназы, регулируемые фосфоинозитидом D3: активация киназы фосфоинозитид-зависимым фосфорилированием. Анну Рев Биохим. 1999; 68: 965–1014. [PubMed] [Google Scholar] 6. Джонс Р.Г., Парсонс М., Боннард М., Чан В.С., Йе В.С., Вудгетт-младший, Охаши П.С. Протеинкиназа B регулирует выживаемость Т-лимфоцитов, активацию ядерного фактора kappaB и уровни Bcl-X (L) in vivo. J Exp Med. 2000; 191: 1721–1734. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7.Кантрелл Д. Регулирование и функция протеинкиназы B (Akt) в Т-лимфоцитах. Semin Immunol. 2002; 14: 19–26. [PubMed] [Google Scholar] 8. Кейн Л.П., Вайс А. Путь киназы PI-3 / Akt и активация Т-клеток: плейотропные пути ниже PIP3. Immunol Rev.2003; 192: 7–20. [PubMed] [Google Scholar] 9. Шарп А.Х., Фриман Г.Дж. Суперсемейство B7-CD28. Nat Rev Immunol. 2002; 2: 116–126. [PubMed] [Google Scholar] 10. Радд CE, Шнайдер Х. Объединение концепций в передаче сигналов корецепторов CD28, ICOS и CTLA4. Nat Rev Immunol.2003. 3: 544–556. [PubMed] [Google Scholar] 11. Okkenhaug K, Wu L, Garza KM, La Rose J, Khoo W., Odermatt B, Mak TW, Ohashi PS, Rottapel R. Точечная мутация в CD28 отличает пролиферативные сигналы от сигналов выживания. Nat Immunol. 2001; 2: 325–332. [PubMed] [Google Scholar] 12. Харада Ю., Токусима М., Мацумото Ю., Огава С., Оцука М., Хаяши К., Вайс Б. Д., Джун С. Н., Абэ Р. Критическое требование для проксимального к мембране цитозольного остатка тирозина для CD28-опосредованной костимуляции in vivo. J Immunol. 2001; 166: 3797–3803.[PubMed] [Google Scholar] 13. Бурр Дж. С., Сэвидж Н. Д., Месса Г. Е., Кимзи С. Л., Шоу А. С., Арч Р. Х., Грин Дж. М.. Передний край: отдельные мотивы в CD28 регулируют пролиферацию Т-клеток и индукцию Bcl-XL. J Immunol. 2001; 166: 5331–5335. [PubMed] [Google Scholar] 14. Койл А.Дж., Лехар С., Ллойд К., Тиан Дж., Делани Т., Мэннинг С., Нгуен Т., Бервелл Т., Шнайдер Х., Гонсало Дж. А., Госселин М., Оуэн Л. Р., Радд К. Э., Гутьеррес-Рамос Дж. Связанная с CD28 молекула ICOS необходима для эффективных Т-клеточно-зависимых иммунных ответов.Иммунитет. 2000. 13: 95–105. [PubMed] [Google Scholar] 15. Fos C, Salles A, Lang V, Carrette F, Audebert S, Pastor S, Ghiotto M, Olive D, Bismuth G, Nunes JA. Лигирование ICOS привлекает регуляторную субъединицу p50alpha PI3K в иммунологический синапс. J Immunol. 2008; 181: 1969–1977. [PubMed] [Google Scholar] 16. Нуриева Р.И., Дуонг Дж., Кишикава Х., Дианзани У., Рохо Дж. М., Хо И., Флавелл Р.А., Донг С. Транскрипционная регуляция дифференцировки th3 индуцибельным костимулятором. Иммунитет. 2003. 18: 801–811. [PubMed] [Google Scholar] 17.Gigoux M, Shang J, Pak Y, Xu M, Choe J, Mak TW, Suh WK. Индуцибельный костимулятор способствует дифференцировке хелперных Т-клеток через фосфоинозитид-3-киназу. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2009; 106: 20371–20376. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Song J, Salek-Ardakani S, Rogers PR, Cheng M, Van Parijs L, Croft M. Регулируемая костимуляцией продолжительность активации PKB контролирует продолжительность жизни Т-клеток. Nat Immunol. 2004. 5: 150–158. [PubMed] [Google Scholar] 19. Song J, So T, Cheng M, Tang X, Croft M. Устойчивая экспрессия сурвивина из костимулирующих сигналов OX40 стимулирует клональную экспансию Т-клеток.Иммунитет. 2005. 22: 621–631. [PubMed] [Google Scholar] 20. Sanjo H, Zajonc DM, Braden R, Norris PS, Ware CF. Аллостерическая регуляция лигаз убиквитин: NIK и TRAF3 E3 рецептором лимфотоксина-β. J Biol Chem. 2010; 285: 17148–17155. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21. Gramaglia I, Weinberg AD, Lemon M, Croft M. Лиганд Ox-40: мощная костимулирующая молекула для поддержания первичных ответов Т-лимфоцитов CD4. J Immunol. 1998; 161: 6510–6517. [PubMed] [Google Scholar] 22. Лассер Р., Гуо XJ, Коншо Ф., Хамон И., Хавар О., Бернар А. М., Суджа С. М., Ленн П. Ф., Риньо Х, Олив Д., Висмут Г., Нуньес Дж. А., Пайрастре Б., Маргет Д., Х. Х.Нанодомены Raft вносят вклад в рекрутирование и активацию плазматической мембраны Akt / PKB. Nat Chem Biol. 2008; 4: 538–547. [PubMed] [Google Scholar] 23. Уэда Ю., Левин Б.Л., Хуанг М.Л., Фриман Г.Дж., Надлер Л.М., Чемпион Джун, С.Г. Уорд. Оба лиганда CD28, CD80 (B7-1) и CD86 (B7-2) активируют фосфатидилинозитол-3-киназу, а вортманнин обнаруживает гетерогенность в регуляции секреции Т-клеточного IL-2. Int Immunol. 1995; 7: 957–966. [PubMed] [Google Scholar] 24. Crooks ME, Littman DR, Carter RH, Fearon DT, Weiss A, Stein PH.CD28-опосредованная костимуляция в отсутствие ассоциации и активации фосфатидилинозитол-3-киназы. Mol Cell Biol. 1995; 15: 6820–6828. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Kane LP, Andres PG, Howland KC, Abbas AK, Weiss A. Akt обеспечивает костимулирующий сигнал CD28 для активации IL-2 и IFN-гамма, но не цитокинов Th3. Nat Immunol. 2001; 2: 37–44. [PubMed] [Google Scholar] 26. Arch RH, Thompson CB. 4-1BB и Ox40 являются членами подсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) — нервного фактора роста, которые связывают факторы, связанные с рецептором TNF, и активируют ядерный фактор kappaB.Mol Cell Biol. 1998. 18: 558–565. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27. Кавамата С., Хори Т., Имура А., Такаори-Кондо А., Учияма Т. Активация путей передачи сигнала OX40 приводит к 2- и TRAF5-опосредованной активации фактора некроза опухоли, связанного с рецептором фактора некроза опухоли (TRAF), NF-kappaB. J Biol Chem. 1998. 273: 5808–5814. [PubMed] [Google Scholar] 28. Croft M, So T, Duan W, Soroosh P. Значение OX40 и OX40L для биологии Т-клеток и иммунных заболеваний. Immunol Rev.2009; 229: 173–191. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29.Ян В.Л., Ван Дж., Чан С.Х., Ли С.В., Кампос А.Д., Ламот Б., Хур Л., Грабинер Б.К., Лин Х, Дарней Б.Г., Линь Х.К. E3-лигаза TRAF6 регулирует убиквитинирование и активацию Akt. Наука. 2009; 325: 1134–1138. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Дикстра М., Черукури А., Сон Х.В., Ценг SJ, Пирс С.К. Местоположение решает все: липидные рафты и сигнализация иммунных клеток. Анну Рев Иммунол. 2003. 21: 457–481. [PubMed] [Google Scholar] 31. Сарбасов Д.Д., Гертин Д.А., Али С.М., Сабатини Д.М. Фосфорилирование и регуляция Akt / PKB комплексом rictor-mTOR.Наука. 2005; 307: 1098–1101. [PubMed] [Google Scholar] 32. Садра А., Синек Т., Имбоден Дж. Б.. Транслокация CD28 в липидные рафты и костимуляция IL-2. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 11422–11427. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Виола А., Шредер С., Сакакибара Ю., Ланзавеккья А. Костимуляция Т-лимфоцитов, опосредованная реорганизацией микродоменов мембран. Наука. 1999. 283: 680–682. [PubMed] [Google Scholar] 34. Вулфинг К., Дэвис ММ. Движение рецептора / цитоскелета, запускаемое костимуляцией во время активации Т-клеток.Наука. 1998. 282: 2266–2269. [PubMed] [Google Scholar] 35. Yokosuka T, Sakata-Sogawa K, Kobayashi W, Hiroshima M, Hashimoto-Tane A, Tokunaga M, Dustin ML, Saito T. Новые микрокластеры рецепторов Т-клеток инициируют и поддерживают активацию Т-клеток за счет рекрутирования Zap70 и SLP-76. Nat Immunol. 2005; 6: 1253–1262. [PubMed] [Google Scholar] 36. Лиллемайер Б.Ф., Мортельмайер М.А., Форстнер М.Б., Хуппа Дж.Б., Гровс Дж.Т., Дэвис М.М. TCR и Lat экспрессируются на отдельных белковых островках на мембранах Т-клеток и сцепляются во время активации.Nat Immunol. 2010; 11: 90–96. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Wong BR, Besser D, Kim N, Arron JR, Vologodskaia M, Hanafusa H, Choi Y. TRANCE, член семейства TNF, активирует Akt / PKB через сигнальный комплекс, включающий TRAF6 и c-Src. Mol Cell. 1999; 4: 1041–1049. [PubMed] [Google Scholar] 38. Arron JR, Vologodskaia M, Wong BR, Naramura M, Kim N, Gu H, Choi Y. Положительная регуляторная роль белков семейства Cbl в активациях цитокинов, связанных с фактором некроза опухолей (транс), и CD40L-опосредованной активации Akt.J Biol Chem. 2001; 276: 30011–30017. [PubMed] [Google Scholar] 39. Benson RJ, Hostager BS, Bishop GA. Для быстрого CD40-опосредованного спасения от CD95-индуцированного апоптоза требуется TNFR-связанный фактор-6 и PI3K. Eur J Immunol. 2006; 36: 2535–2543. [PubMed] [Google Scholar] 40. Озес О.Н., Мейо Л.Д., Гастин Дж.А., Пфеффер С.Р., Пфеффер Л.М., Доннер ДБ. Активация NF-kappaB фактором некроза опухоли требует серин-треонинкиназы Akt. Природа. 1999; 401: 82–85. [PubMed] [Google Scholar] 41. Пинчейра Р., Кастро А.Ф., Озес О.Н., Идумалла П.С., Доннер Д.Б.Рецептор TNF типа 1 образует комплекс с Jak2 и c-Src и использует их для избирательного задействования сигнальных путей, регулирующих активность фактора транскрипции. J Immunol. 2008; 181: 1288–1298. [PubMed] [Google Scholar] 42. Secchiero P, Gonelli A, Carnevale E, Milani D, Pandolfi A, Zella D, Zauli G. TRAIL способствует выживанию и пролиферации первичных эндотелиальных клеток сосудов человека, активируя пути Akt и ERK. Тираж. 2003. 107: 2250–2256. [PubMed] [Google Scholar] 43. Сонг Дж. Дж., Ким Дж. Х., Сан Б. К., Алькала М. А., младший, Бартлетт Д. Л., Ли Ю. Дж.c-Cbl действует как медиатор Src-индуцированной активации пути передачи сигнала PI3K-Akt во время лечения TRAIL. Сотовый сигнал. 2010. 22: 377–385. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Путь Akt / PKB: молекулярная мишень для открытия лекарств от рака

Abraham RT. (2004). Восстановление ДНК , 3 , 883–887.

Adini I, Rabinovitz I, Sun JF, Prendergast GC и Benjamin LE. (2003). Genes Dev. , 17 , 2721–2732.

Алесси Д.Р., Анджелкович М., Кодвелл Б., Крон П., Моррис Н., Коэн П. и Хеммингс Б.А. (1996). EMBO J. , 15 , 6541–6551.

Алесси Д.Р., Джеймс С.Р., Даунс С.П., Холмс А.Б., Гаффни П.Р., Риз С.Б. и Коэн П. (1997). Curr. Биол. , 7 , 261–269.

Altomare DA, Tanno S, De Rienzo A, Klein-Szanto AJ, Tanno S, Skele KL, Hoffman JP и Testa JR. (2003). J. Cell Biochem. , 88 , 470–476.

Altomare DA, Wang HQ, Skele KL, De Rienzo A, Klein-Szanto AJ, Godwin AK и Testa JR. (2004). Онкоген , 23 , 5853–5857.

Альтомаре Д.А., Ю Х, Сяо Г.Х., Рамос-Нино М.Э., Скеле К.Л., Де Риенцо А., Джанвар СК, Моссман Б.Т., Кейн А.Б. и Теста-младший. (2005). Онкоген [Epub перед печатью].

Altomare DA и Testa JR. (2005). Онкоген Ред. , 24 , 7455–7464.

Arcaro A и Wymann MP.(1993). Biochem. J. , 269 , 297–301.

Arlt A, Gehrz A, Muerkoster S, Vorndamm J, Kruse ML, Folsch UR и Schafer H. (2003). Онкоген , 22 , 3243–3251.

Asnaghi L, Calastretti A, Bevilacqua A, D’Agnano I, Gatti G, Canti G, Delia D, Capaccioli S и Nicolin A. (2004). Онкоген , 23 , 5781–5791.

Оген Д., Барт П., Ройер С., Стерн М. Х., Ногучи М., Арольд С. Т. и Румстанд С.(2004). J. Biol. Chem. , 279 , 35890–35902.

Балендран А., Касамайор А., Дик М., Патерсон А., Гаффни П., Карри Р., Даунс С.П. и Алесси Д.Р. (1999). Curr. Биол. , 9 , 393–404.

Balsara BR, Pei J, Mitsuuchi Y, Page R, Klein-Szanto A, Wang H, Unger M и Testa JR. (2004). Канцерогенез , 25 , 2053–2059.

Барнетт С.Ф., Билодо М.Т. и Линдсли С.В.(2005a). Curr. Top Med. Chem. , 5 , 109–125.

Барнетт С.Ф., Дефео-Джонс Д., Фу С., Хэнкок П.Дж., Хаскелл К.М., Джонс Р.Э., Кахана Д.А., Крал А.М., Леандер К., Ли Л.Л., Малиновски Дж., МакЭвой Е.М., Нахас Д.Д., Робинсон Р.Г. и Хубер Х. . (2005b). Biochem. J. , 385 , 399–408.

Bellacosa A, Testa JR, Staal SP и Tsichlis PN. (1991). Science , 254 , 274–277.

Bellacosa A, de Feo D, Godwin AK, Bell DW, Cheng JQ, Altomare DA, Wan M, Dubeau L, Scambia G и Masciullo V et al.(1995). Внутр. J. Cancer , 64 , 280–285.

Бразилия Д.П., Парк Дж. И Хеммингс Б.А. (2002). Ячейка , 111 , 293–303.

Breitenlechner CB, Friebe WG, Brunet E, Werner G, Graul K, Thomas U, Kunkele KP, Schafer W., Gassel M, Bossemeyer D, Huber R, Engh RA и Masjost B. (2005). J. Med. Chem. , 48 , 163–170.

Burgering BMT и Coffer PJ. (1995). Природа , 376 , 599−602.

Castillo SS, Brognard J, Petukhov PA, Zhang C., Tsurutani J, Granville CA, Li M, Jung M, West KA, Gills JG, Kozikowski AP and Dennis PA. (2004a). Cancer Res. , 64 , 2782–2792.

Castillo SS, Brognard J, Petukhov PA, Zhang C., Tsurutani J, Granville CA, Li M, Jung M, West KA, Gills JG, Kozikowski AP and Dennis PA. (2004b). Cancer Res. , 64 , 2782–2792.

Чан С. (2004). Br. J. Cancer , 91 , 1420–1424.

Chan TO, Rittenhouse SE и Tsichlis PN. (1999). Annu. Rev. Biochem. , 68 , 965–1014.

Чен Дж.С., Лан К. и Хунг М.С. (2003). Устойчивость к наркотикам. Updat. , 6 , 129–136.

Chen WS, Xu PZ, Gottlob K, Chen ML, Sokol K, Shiyanova T., Roninson I, Weng W, Suzuki R, Tobe K, Kadowaki T. и Hay N. (2001). Genes Dev. , 15 , 2203–2208.

Cheng JQ, Altomare DA, Klein MA, Lee WC, Kruh GD, Lissy NA и Testa JR. (1997). Онкоген , 14 , 2793–2801.

Cheng JQ, Godwin AK, Bellacosa A, Taguchi T., Franke TF, Hamilton TC, Tsichlis PN и Testa JR. (1992). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 89 , 9267–9271.

Cheng JQ, Jiang X, Fraser M, Li M, Dan HC, Sun M и Tsang BK. (2002). Устойчивость к наркотикам. Updat. , 5 , 131–146.

Cheng JQ, Ruggeri B, Klein WM, Sonoda G, Altomare DA, Watson DK и Testa JR. (1996). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 93 , 3636–3641.

Чо Х, Му Дж, Ким Дж. К., Торвальдсен Дж. Л., Чу К., Креншоу III Э. Б., Кестнер К. Х., Бартоломей М. С., Шульман Г. И. и Бирнбаум М. Дж.. (2001a). Science , 292 , 1728–1731.

Чо Х, Торвальдсен Дж.Л., Чу К., Фенг Ф. и Бирнбаум М.Дж. (2001b). J. Biol. Chem., 276 , 38349–38352.

Chung FL, Schram KH, Panzica RP, Earl RA, Wotring LL и Townsend LB. (1980). J. Med. Chem. , 23 , 1158–1166.

Кларк М. (2000). Immunol. Сегодня , 21 , 397–402.

Cobb WR, Bogden AE, Reich SD, Griffin TW, Kelton DE и LePage DJ. (1983). Cancer Treat Rep. , 67 , 173–178.

Coffer PJ and Woodgett JR.(1991). Eur. J. Biochem. , 201 , 475–481.

Дэн Х.С., Цзян К., Коппола Д., Гамильтон А., Никосия С. В., Себти С. М. и Ченг Дж. К.. (2004). Онкоген , 23 , 706–715.

Datta K, Bellacosa A, Chan TO и Tsichlis PN. (1996). J. Biol. Chem. , 271 , 30835–30839.

Datta SR, Brunet A и Greenberg ME. (1999). Genes Dev. , 13 , 2905-2927.

Дефео-Джонс Д., Барнетт С.Ф., Фу С., Хэнкок П.Дж., Хаскелл К.М., Леандер К.Р., МакЭвой Е., Робинсон Р.Г., Дагган М.Э., Линдсли К.В., Чжао З., Хубер Х.Э. и Джонс Р.Э. (2005). Мол. Рак Тер. , 4 , 271–279.

deGraffenried LA, Friedrichs WE, Russell DH, Donzis EJ, Middleton AK, Silva JM, Roth RA и Hidalgo M. (2004). Clin. Cancer Res. , 10 , 8059–8067.

Истон Р.М., Чо Х., Руверс К., Шинман Д.В., Мизрахи М., Форман М.С., Ли В.М., Сабольч М., де Йонг Р., Олтерсдорф Т., Людвиг Т., Эфстратиадис А. и Бирнбаум М.Дж.(2005). Мол. Cell Biol. , 25 , 1869–1878.

Edinger AL, Linardic CM, Chiang GG, Thompson CB и Abraham RT. (2003). Cancer Res. , 63 , 8451–8460.

Fan QW, Specht KM, Zhang C, Goldenberg DD, Shokat KM и Weiss WA. (2003). Cancer Res. , 63 , 8930–8938.

Feldman RI, Wu JM, Polokoff MA, Kochanny MJ, Dinter H, Zhu D, Biroc SL, Alicke B, Bryant J, Yuan S, Buckman BO, Lentz D, Ferrer M, Whitlow M, Adler M, Finster S, Chang Z и Arnaiz DO.(2005). J. Biol. Chem. , 280 , 19867–19874.

Фенг Дж., Парк Дж., Крон П., Хесс Д. и Хеммингс Б.А. (2004). J. Biol. Chem. , 279 , 41189–41196.

Feun LG, Blessing JA, Barrett RJ и Hanjani P. (1993). Am. J. Clin. Онкол. , 16 , 506–508.

Feun LG, Savaraj N, Bodey GP, Lu K, Yap BS, Ajani JA, Burgess MA, Benjamin RS, McKelvey E and Krakoff I. (1984). Cancer Res. , 44 , 3608–3612.

Finan PM и Thomas MJ. (2004). Biochem. Soc. Пер. , 32 , 378–382.

Fishwild DM, O’Donnell SL, Bengoechea T., Hudson DV, Harding F, Bernhard SL, Jones D, Kay RM, Higgins KM, Schramm SR and Lonberg N. (1996). Нат. Biotechnol. , 14 , 845–851.

Franke TF, Yang SL, Chan TO, Datta K, Kazlauskas A, Morrison DK, Kaplan DR и Tsichlis PN.(1995). Ячейка , 81 , 727-736.

Джордж С., Рочфорд Дж. Дж., Вольфрам С., Грей С.Л., Шиннер С., Уилсон Дж. К., Соос М.А., Мургатройд П.Р., Уильямс Р.М., Асерини К.Л., Дангер ДБ, Барфорд Д., Амплби А.М., Уэрхэм Нью-Джерси, Дэвис Ха, Шафер AJ, Stoffel M, O’Rahilly S и Barroso I. (2004). Science , 304 , 1325–1328.

Hiromura M, Okada F, Obata T, Auguin D, Shibata T, Roumestand C и Noguchi M. (2004). J. Biol. Chem., 279 , 53407–53418.

Хоффман К., Холмс Ф.А., Фрашини Дж., Эспарза Л., Фрай Д., Рабер М.Н., Ньюман Р.А. и Хортобадьи Г.Н. (1996). Рак химиотерапия. Pharmacol. , 37 , 254–258.

Хатчинсон Дж., Джин Дж., Кардифф РД, Вудгетт Дж. Р. и Мюллер В. Дж.. (2001). Мол. Cell Biol. , 21 , 2203–2212.

Jiang K, Coppola D, Crespo NC, Nicosia SV, Hamilton AD, Sebti SM and Cheng JQ.(2000). Мол. Клетка. Биол. , 20 , 139–148.

Jiang K, Sun J, Cheng JQ, Djeu JY, Wei S и Sebti SM. (2004). Мол. Cell Biol. , 24 , 5565–5576.

Джонсон М.А. и Пинто Б.М. (2002). Aust. J. Chem. , 55 , 13–25.

Джонс П.Ф., Якубович Т., Питосси Ф.Дж., Маурер Ф. и Хеммингс Б.А. (1991). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 88 , 4171–4175.

Каваками Ю., Нисимото Х., Китаура Дж., Маэда-Ямамото М., Като Р.М., Литтман Д.Р., Ролингс Д.Д. и Каваками Т. (2004). J. Biol. Chem. , 279 , 47720–47725.

Ким Д., Дэн Х.С., Пак С., Ян Л., Лю К., Канеко С., Нин Дж., Хе Л., Ян Х, Сун М., Никосия С. В. и Ченг Дж. К.. (2005). Front Biosci. , 10 , 975–987.

Кнуферманн С., Лу И, Лю Б., Джин В., Лян К., Ву Л., Шмидт М., Миллс ГБ, Мендельсон Дж. И Фан З.(2003). Онкоген , 22 , 3205–3512.

Командер Д., Кулар Г.С., Бейн Дж., Эллиотт М., Алесси Д.Р. и Ван Аалтен Д.М. (2003). Biochem. J. , 375 , 255–262.

Кондапака С.Б., Сингх С.С., Дасмахапатра Г.П., Саусвилл Е.А. и Рой К.К. (2003). Мол. Рак Тер. , 2 , 1093–1103.

Козиковски А.П., Киддл Дж. Дж., Фрю Т., Берггрен М. и Поуис Г. (1995). J. Med. Chem. , 38 , 1053–1056.

Кумар С.К. и Мэдисон В. (2005). Онкоген Ред. , 24 , 7493–7501.

Лайне Дж., Кунстле Дж., Обата Т., Ша М. и Ногучи М. (2000). Мол. Клетка. , 6 , 395–407.

Li J, Yen C, Liaw D, Podsypanina K, Bose S, Wang SI, Puc J, Miliaresis C, Rodgers L, McCombie R, Bigner SH, Giovanella BC, Ittmann M, Tycko B, Hibshoosh H, Wigler MH и Парсонс Р. (1997). Science , 275 , 1943–1947.

Линдсли К.В., Чжао З., Лейстер WH, Робинсон Р.Г., Барнетт С.Ф., Дефео-Джонс Д., Джонс Р.Э., Хартман Г.Д., Хафф Дж.Р., Хубер Х.Э. и Дагган М.Э. (2005). Bioorg. Med. Chem. Lett. , 15 , 761–764.

Лю A-X и Prendergast GC. (2000). FEBS Lett. , 481 , 205–208.

Лю A-X, Testa JR, Hamilton TC, Jove R, Nicosia SV и Cheng JQ. (1998). Cancer Res. , 58, , 2973−2977.

Луо И, Смит Р.А., Гуан Р., Лю Х, Клингхофер В., Шен Дж., Хатчинс К., Ричардсон П., Хольцман Т., Розенберг С.Х. и Джиранда В.Л. (2004). Биохимия , 43 , 1254–1263.

Majumder PK, Febbo PG, Bikoff R, Berger R, Xue Q, McMahon LM, Manola J, Brugarolas J, McDonnell TJ, Golub TR, Loda M, Lane HA и Sellers WR. (2004). Нат. Med. , 10 , 594–601.

Majumder PK, Yeh JJ, George DJ, Febbo PG, Kum J, Xue Q, Bikoff R, Ma H, Kantoff PW, Golub TR, Loda M и Sellers WR.(2003). Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. , 100 , 7841–7846.

Мальстрем С., Тили Э., Каппес Д., Сеси Д.Д. и Цихлис П.Н. (2001). Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. , 98 , 14967–14972.

Мандал М., Ким С., Юнес М.Н., Джассер С.А., Эль-Наггар А.К., Миллс Г.Б. и Майерс Дж. (2005). Br. J. Cancer , 92 , 1899–1905.

McCafferty J, Griffiths AD, Winter G и Chiswell DJ. (1990). Nature , 348 , 552–554.

Mende I, Malstrom S, Tsichlis PN, Vogt PK и Aoki M. (2001). Онкоген , 20 , 4419–4423.

Meric-Bernstam F and Mills GB. (2004). Семин. Онкол. , 31 , 10–17.

Migawa MT, Drach JC и Townsend LB. (2005). J. Med. Chem. , 48 , 3840–3851.

Mitsiades CS, Mitsiades N и Koutsilieris M.(2004). Curr. Цели противораковых препаратов , 4 , 235–256.

Миттельман А., Каспер Э.С., Годвин Т.А., Кэссиди С. и Янг CW. (1983). Cancer Treat Rep. , 67 , 159–162.

Мора А., Командер Д., ван Аалтен Д.М. и Алесси Д.Р. (2004). Семин. Cell Dev. Биол. , 15 , 161–170.

Нагата Ю., Лан К.Х., Чжоу Х, Тан М., Эстева Ф.Дж., Сахин А.А., Клос К.С., Ли П., Мония Б.П., Нгуен Н.Т., Хортобадьи Г.Н., Хунг М.С. и Ю Д.(2004). Раковые клетки , 6 , 117–127.

Парсонс Р. (2004). Semin Cell Dev. Биол. , 15 , 171–176.

Partovian C и Simons M. (2004). сотовый сигнал. , 16 , 951–957.

Пекарский Ю., Коваль А., Халлас С., Бичи Р., Трезини М., Мальстрем С., Руссо Г., Цихлис П. и Кроче С.М. (2000). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 97 , 3028–3033.

Persad S, Attwell S, Gray V, Mawji N, Deng JT, Leung D, Yan J, Sanghera J, Walsh MP и Dedhar S.(2001). J. Biol. Chem. , 276 , 27462–27469.

Powis G, Aksoy IA, Melder DC, Aksoy S, Eichinger H, Fauq AH и Kozikowski AP. (1991). Рак химиотерапия. Pharmacol. , 29 , 95–104.

Powis G, Basseches PJ, Kroschel DM, Richardson RL, O’Connell MJ и Kvols LK. (1986). Cancer Treat Rep. , 70 , 359–362.

Prendergast GC. (2000). Curr. Opin. Cell Biol., 12 , 166–173.

Рао Р.Д., Бакнер Дж. К. и Саркария Дж. Н.. (2004). Curr. Противораковые препараты, цели , 4 , 621–635.

Remy I, Montmarquette A и Michnick SW. (2004). Нат. Cell Biol. , 6 , 358–365.

Реувени Х., Ливна Н., Гейгер Т., Кляйн С., Он О., Коэн И., Бенхар М., Геллерман Г. и Левицки А. (2002). Биохимия , 41 , 10304–10314.

Садху К., Масиновски Б., Дик К., Соуэлл К.Г. и Стонтон Д.Е.(2003). J. Immunol. , 170 , 2647–2654.

Сарбасов Д.Д., Гертин Д.А., Али С.М. и Сабатини Д.М. (2005). Science , 307 , 1098–1101.

Sato S, Fujita N и Tsuruo T. (2002). Онкоген , 21 , 1727–1738.

Schilcher RB, Haas CD, Samson MK, Young JD и Baker LH. (1986). Cancer Res. , 46 , 3147–3151.

Sebti SM и Der CJ.(2003). Нат. Rev. Cancer , 3 , 945–951.

Семба С., Ито Н, Ито М, Харада М. и Ямакава М. (2002). Clin. Cancer Res. , 8 , 1957–1963.

Senderowicz AM. (2003a). Рак химиотерапия. Pharmacol. , 52 , S61 – S73.

Зендерович AM. (2003b). Онкоген , 22 , 6609–6620.

Шоу М., Коэн П. и Алесси Д.Р.(1998). Biochem. J. , 336 , 241−246.

Shin I, Edl J, Biswas S, Lin PC, Mernaugh R и Arteaga CL. (2005). Cancer Res. , 65 , 2815–2824.

Шинтани Т. и Клионски Диджей. (2004). Science , 306 , 990–995.

Staal SP, Hartley JW и Rowe WP. (1977). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 74 , 3065–3067.

Стаал СП.(1987). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 84 , 5034–5037.

Стамболик В., Сузуки А, де ла Помпа Дж. Л., Братья Дж. М., Миртсос С., Сасаки Т., Руланд Дж., Пеннингер Дж. М., Сидеровски Д. П. и Мак Т.В.. (1998). Ячейка , 95, , 29-39.

Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, Yung WKA, Lin H, Ligon AH, Langford LA, Baumgard ML, Hattier T, Davis T, Frye C, Hu R, Swedlund B, Teng DHF и Tavtigian SV. (1997). Нат. Genet. , 15 , 356–362.

Sun M, Paciga JE, Feldman RI, Yuan Z, Coppola D, Lu YY, Shelley SA, Nicosia SV и Cheng JQ. (2001a). Cancer Res. , 61 , 5985–5991.

Сан М., Ван Г, Пачига Дж. Э., Фельдман Р. И., Юань З., Ма Х, Шелли С. А., Джов Р., Цихлис П. Н., Никосия С. В. и Ченг Дж. К.. (2001b). Am. J. Pathol. , 159 , 431–437.

Сунь М., Ян Л., Фельдман Р.И., Сунь ХМ, Бхалла К.Н., Джов Р., Никосия С.В. и Ченг Дж.К. (2003). J. Biol. Chem. , 278 , 42992–43000.

Табеллини Г., Каппеллини А, Таццари П.Л., Фала Ф, Билли А.М., Манзоли Л., Кокко Л. и Мартелли А.М. (2005). J. Cell Physiol. , 202 , 623–634.

Testa JR и Bellacosa A. (2001). Proc. Natl. Акад. Sci. США , 98 , 10983–10985.

Токер А и Ньютон А. (2000). J. Biol. Chem. , 275 , 8271–8274.

Tschopp O, Yang ZZ, Brodbeck D, Dummler BA, Hemmings-Mieszczak M, Watanabe T., Michaelis T., Frahm J and Hemmings BA. (2005). Развитие , 132 , 2943–2954.

Ван Уммерсен Л., Бингер К., Фолькман Дж., Марноча Р., Тутч К., Колесар Дж., Арзуманиан Р., Альберти Д. и Уайлдинг Дж. (2004). Clin. Cancer Res. , 10 , 7450–7456.

Vink SR, Schellens JH, van Blitterswijk WJ и Verheij M.(2005). Инвест. Новые лекарства , 23 , 279–286.

Vlahos CJ, Matter MF, Hui KY и Brown RF. (1994). J. Biol. Chem. , 269 , 5241–5248.

Wetzker R и Rommel C. (2004). Curr. Pharm. Des. , 10 , 1915–1922.

Вотринг LL, Crabtree GW, Edwards NL, Parks Jr RE и Townsend LB. (1986). Cancer Treat Rep. , 70 , 491–497.

Wymann MP, Bulgarelli-Leva G, Zvelebil MJ, Pirola L, Vanhaesebroeck B., Waterfield MD и Panayatou G.(1996). Мол. Клетка. Биол. , 16 , 1722–1733.

Yakes FM, Chinratanalab W, Ritter CA, King W, Seelig S и Arteaga CL. (2002). Cancer Res. , 62 , 4132–4141.

Ян Дж., Крон П., Томпсон В., Гуд В.М., Хесс Д., Хеммингс Б.А. и Барфорд Д. (2002). Мол. Мобильный , 9 , 1227–1240.

Ян Л., Дэн Х. С., Сун М., Лю К., Сан Х. М., Фельдман Р. И., Гамильтон А. Д., Полокофф М., Никосия С. В., Херлин М., Себти С. М. и Ченг Дж. К..(2004). Cancer Res. , 64 , 4394–4399.

Yu D и Hung MC. (2000). Онкоген , 19 , 6115–6121.

Yuan ZQ, Feldman RI, Sussman GE, Coppola D, Nicosia SV и Cheng JQ. (2003). J. Biol. Chem. , 278 , 23432–23440.

Yuan ZQ, Sun M, Feldman RI, Wang G, Ma X, Jiang C, Coppola D, Nicosia SV и Cheng JQ. (2000). Онкоген , 19 , 2324–2330.

Чжао Б., Бауэр М.Дж., МакДевитт П.Дж., Чжао Х.З., Дэвис С.Т., Йохансон К.О., Грин С.М., Конча Н.О. и Чжоу BBS. (2002). J. Biol. Chem. , 277 , 46609–46615.

Чжао З., Лейстер WH, Робинсон Р.Г., Барнетт С.Ф., Дефео-Джонс Д., Джонс Р.Э., Хартман Г.Д., Хафф Дж.Р., Хубер Х.Э., Дагган М.Э. и Линдсли К.В. (2005). Bioorg. Med. Chem. Lett. , 15 , 905–909.

Что такое pKb основания, сопряженная кислота которого имеет pKa 11.54?

Вопрос:

Что такое pKb основания, конъюгированная кислота которого имеет pKa 11,54?

Кислотно-основное равновесие.

Кислота в водном растворе дает протон, а основание принимает его. — {/ eq} (водн.) представляет собой основание, сопряженное с кислотой HA ?.{- 14}) {/ eq} Мы знаем,

{eq} — \ log (k_a) = pk_a \ и — \ log (k_b) = pk_b {/ eq}

Итак,

{eq} pk_a + pk_b = 14 {/ eq}

Ответ и объяснение: 1

Дано:

{eq} pk_a {/ eq} = 11,54

Чтобы определить: {eq} pk_b {/ eq} (сопряженное основание)

Шаг 1

Используйте следующее выражение.

{eq} pk_a + pk_b = 14 {/ eq}

ул …

См. Полный ответ ниже.

.

No related posts.