Коллекторское агентство фасп: ФАСП | Контакты

Содержание

ООО «СФО Ф-Капитал» — Банк «ТРАСТ» (ПАО)

Переуступка долга

В соответствии со ст. 382, 384 Гражданского Кодекса Российской Федерации уведомляем Вас о переуступке Вашего долга.

12 мая 2020 г. между Обществом с ограниченной ответственностью «Коллекторское агентство «Бизнесактив»» и Акционерным обществом «Финансовое Агентство по Сбору Платежей» (АО «ФАСП») заключены договоры цессии № 1, 2, 3, 4, 5 о переуступке права требования по кредитным и иным договорам, заключенным между Банком «ТРАСТ» (ПАО) и физическими лицами.

12 мая 2020 г. между Обществом с ограниченной ответственностью «Коллекторское агентство «Право и бизнес»» и Акционерным обществом «Финансовое Агентство по Сбору Платежей» (АО «ФАСП») заключены договоры цессии № 6, 7 о переуступке права требования по кредитным и иным договорам, заключенным между Банком «ТРАСТ» (ПАО) и физическими лицами.

13 мая 2020 г. между АО «ФАСП» и Обществом с ограниченной ответственностью «Специализированное финансовое общество Ф-Капитал» (ООО «СФО Ф-Капитал») заключены договоры цессии № 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 о переуступке права требования по кредитным и иным договорам, заключенным между Банк «ТРАСТ» (ПАО) и физическими лицами.

В результате переуступки права требования новым кредитором для физических лиц, заключивших кредитные и иные договоры с Банк «ТРАСТ» (ПАО) является ООО «СФО Ф-Капитал».

Новый кредитор

  • Наименование: ООО «СФО Ф-Капитал»
  • ОГРН: 1197746534831
  • ИНН: 9704000282

ООО «СФО Ф-Капитал» является специализированным финансовым обществом, предметом деятельности которого является приобретение имущественных прав требования к заемщикам об уплате денежных средств по кредитным договорам, договорам займа и (или) иным обязательствам, и осуществление эмиссии облигаций, обеспеченных залогом приобретенных прав требования.

Управляющей компанией ООО «СФО Ф-Капитал» является ООО «ТПМ Управление проектами», включенное 06.06.2019 г. в реестр управляющих компаний специализированных обществ (Уведомление Банка России от 06.06.2019 № 14-8-18/6656).

Контактные данные нового кредитора

  • Адрес: 129090, город Москва, Ботанический переулок, д. 5, этаж 5 пом. 17А РМ1
  • Сайт: https://sfo-fc.ru
  • Контактный телефон: +7 (495) 139 10 87
  • Электронная почта: [email protected]с.ru

Схема расположения офиса

ФАСП, ЗАО Финансовое Агентство по Сбору Платежей

Почтовый индекс 690018

Владивосток,
улица Невская, 12а

8 (423) 236-69-26

http://www.fasp.ru


  • Коллекторские агентства;
  • Юридические услуги

ФАСП – первое независимое профессиональное коллекторское агентство в РФ Группа предприятий ФАСП — профессиональная, энергично развивающаяся фирма. 9 августа две тысячи четвертого года ЗАО «ФАСП» было зарегистрировано как первое коллекторское агентство в РФ. Фирма фактически стояла у истоков формирования российского рынка проф. коллекторских услуг. В две тысячи пятом году Группа предприятий ФАСП начала энергично развивать региональную сеть. Сбалансированная региональная сеть ФАСП охватывает всю территорию России от Северо-Запада до Дальнего Востока, территорию Украины и Республики Казахстан. На данный день ГК ФАСП присутствует в не менее чем 110 городах федерального и республиканского значения, областных центрах и больших населенных пунктах РФ, Казахстана и Украины. В Москве, Омске, Воронеже, Алматы и Киеве действуют проф. контакт-центры ГК ФАСП. В том же году ФАСП вступает в Международную Сеть Коллекторских Агентств GCS. В две тысячи шестом году фирма выходит на рынок сбора платежей СНГ и открывает филиал ФАСП в городе Алматы, одном из ключевых экономических центров Казахстана.

«ФАСП» на карте Владивостока

Последний отзыв:

Об этой компании еще нет ни одного отзыва

В России создаются коллекторские агентства — Российская газета

Создание института коллекторских агентств на российской почве напрямую связано со стремительным развитием рынка потребительского кредитования, которое наблюдается у нас в последнее время. Пока в России две полноценные коллекторские компании, их стаж невелик — менее года. Хотя сам бизнес зародился раньше. В коммерческих банках, которые активно занимались потребительским кредитованием, сначала возникли отделы по работе с просроченными долгами. Но по мере того как объем подобной задолженности возрастал, рынок все явственней ощущал потребность в более профессиональной деятельности.

 

По официальной статистике, уровень просроченной задолженности в России сегодня не превышает 1,5 процента. Однако реальный ее размер, по экспертным оценкам, куда больше — 5-7 процентов от общего объема выданных потребительских кредитов. А по отдельным видам кредитования долги достигают 15-20 процентов. Число же банковских клиентов, которые попадают в разряд должников в течение первого месяца, то есть задерживают первый же свой платеж, может достигать, как показывает опыт, 25 процентов.

Аналитики делят должников на несколько категорий. В первой так называемые «забывчатые». Те, кто, взяв кредит, не следит за наступлением срока его погашения.

Вторая категория — «проблемники», то есть люди, которые испытывают финансовые затруднения. Например, им не выплатили вовремя заработную плату, что для России отнюдь не редкость, в результате нет возможности произвести платеж.

Третью группу можно условно назвать «эгоистами»: им просто не хочется выполнять взятые на себя обязательства. Они не заплатят деньги до тех пор, пока не почувствуют на собственной шкуре, что просрочка платежа по кредиту может обернуться для них серьезными проблемами.

И наконец — «мошенники», то есть те, кто изначально не собирался платить по долгам. Количество таких людей относительно невелико — примерно 15 процентов от общего числа неплательщиков.

По общемировой практике, если коллекторское агентство взыскивает в пользу банка долг, то последний выплачивает ему комиссию. Существует разная практика оплаты услуг коллекторов. Очень редки случаи, когда коллекторское агентство выкупает долг на себя. Хотя российские банки могут быть заинтересованы именно в таких услугах, так как здесь имеется несколько удобных для них моментов. Во-первых, баланс очищается от проблемной задолженности, во-вторых, банк сразу получает деньги.

Коллекторское агентство может также осуществлять поиск информации о том или ином заемщике. Для России эта часть его деятельности представляет повышенный интерес, так как у нас пока очень несовершенная система идентификации клиентов. Обычно отсутствует полная база данных, которая помогает оценить риск и в короткий срок возвратить кредит.

При этом коллекторские агентства не только занимаются взысканием кредитов, но и профилактикой кредитной задолженности. Профилактика заключается в том, что коллекторы, обладая опытом в сфере потребительского кредитования, работают с банками в режиме предупреждения выдачи ими рискованных кредитов.

В России коллекторские агентства делают первые шаги. По словам управляющего одного из российских агентств Евгения Берштрама, банкам предлагаются разные варианты сотрудничества — от рассылки почтовых уведомлений до контроля за работой судебных приставов.

Есть и первые серьезные результаты. Удалось выявить людей, имеющих большую задолженность по кредитам,и, как признается Евгений Берштрам, сделать их невыездными. Причем для этого не потребовалось обращаться в правоохранительные органы, достаточно иметь современную технику и хороших адвокатов.

По словам Берштрама, сегодня в портфеле компании кредитной задолженности на 10 миллионов долларов. Интересно, что первыми клиентами агентства были иностранные банки, работающие в нашей стране. А вот с российскими банками поначалу хорошего взаимодействия не получилось. Во многом это было связано с их стремлением защитить честь мундира. Службы безопасности банков хотели сами выполнять эту работу. Но такое стремление ведет лишь к росту издержек.

По мнению консультанта коллекторского агентства ФАСП Александра Морозова, для банков их работа весьма выгодна. Ведь они ничего не платят за услуги коллекторскому бюро, которое получает свою комиссию лишь в том случае, если долг будет взыскан. В противном же варианте кредитная организация просто бы списала его на убыток.

В то же время правовое поле для деятельности коллекторских агентств разработано недостаточно. С этим приходится считаться, страхуясь и перестраховываясь. Поэтому вся информация, отмечает Берштрам, берется исключительно из официальных источников.

Второй важный вопрос — взаимоотношения с судебными приставами. Нельзя сказать, что они отлажены так, как хотелось бы агентству. А без должного усердия пристава нет гарантии, что судебное решение будет исполнено.

Коллекторские агентства за рубежом

Первые коллекторские агентства появились в США. Сегодня в стране действуют 6500 подобных структур. Отработана устойчивая процедура работы банков с проблемными кредитами. В первый месяц возникновения неплатежа банк действует самостоятельно, звонит задолжнику и просит погасить долг. Если должник быстро откликается на напоминание, то кредитная линия может быть возобновлена. На 30-й день задолженности кредит признается проблемным, на эту сумму начисляют повышенные проценты, штрафы, пени. Если задолжник кредит погасит, то он может быть возобновлен, но это происходит только примерно в 30 процентах случаев.

90-й день — это последний день, когда банки работают по проблемному кредиту. На 91-й день разбираться поручается независимому коллекторскому агентству, а сам кредит блокируется. И если даже заемщик погасит свой долг, кредитный продукт все равно уже не возобновляется.

На 210-й день долга информация о должнике уже поступает из коллекторского агентства в кредитное бюро. И там заводится на него дело.

В США плата за услуги коллекторских фирм зависит от того, на какой стадии они подключаются к работе с «плохим» кредитом. На ранних этапах досудебных решений агентства берут 20-25 процентов от суммы взимаемого долга, на более поздних, «запущенных» стадиях — 45-50 процентов. Такая разница возникает потому, что несмотря на наличие судебного решения самое главное в работе коллекторского агентства — это не получить постановление суда, а вместе с институтом судебных приставов добиться его исполнения. Если же агентство покупает задолженность, то обычно это происходит по цене от 2 до 5 центов за один доллар долга.

Улучшение покрытия протеомом и извлечения проб с помощью Enhanced FASP (eFASP) для количественных протеомных экспериментов

Резюме

Усовершенствованная подготовка проб с фильтрацией (eFASP) включает поверхностно-активные вещества, улучшающие пассивацию и переваривание пластика, в традиционный рабочий процесс FASP для снижения потерь проб и повышения гидрофобности. представление белков в качественных и количественных экспериментах по протеомике. Полученные гидролизаты белков не содержат примесей и могут быть проанализированы непосредственно с помощью ЖХ-МС.

Ключевые слова: Усовершенствованная подготовка проб с помощью фильтра, количественная протеомика, детергент, дезоксихолат аммония

1. Введение

Целостность протеомных экспериментов зависит от последовательной и надежной экстракции, солюбилизации и переваривания белков. Протоколы, использующие анионные детергенты и/или хаотропы для эффективной экстракции и солюбилизации клеточных и матриксных белков, дают образцы, которые должны быть очищены перед расщеплением и анализом. Такие методы, как органическое осаждение, удаляющие загрязняющие вещества, денатурирующие вещества и другие нежелательные вещества ( e.грамм. , соли, нуклеиновые кислоты, липиды и алкилирующие реагенты), подвержены плохому извлечению, проблемам повторного растворения и межбелковым вариациям. Усовершенствованная система подготовки образцов с помощью фильтра (eFASP) обеспечивает эффективную экстракцию, очистку и расщепление белков для различных образцов (1,2).

Традиционная подготовка проб с помощью фильтра (FASP) позволяет обойти многие проблемы очистки белков за счет замены буферов в блоках спиновых фильтров (узлов ультрафильтрации), которые могут полностью удалить додецилсульфат натрия (SDS) и загрязнители пробы (3,4).Белки восстанавливаются, алкилируются, промываются и перевариваются в блоке фильтрации, высвобождая продукт, не содержащий детергента, восстановителя и алкилирующего агента. Тем не менее, при применении этого метода к очень малым размерам выборки потери выборки могут составлять около 50 % (5). Enhanced FASP (eFASP) решает эту проблему за счет включения дезоксихолевой кислоты и, при необходимости, TWEEN ® -20 в рабочий процесс FASP.

Дезоксихолевая кислота (DCA) представляет собой вторичную желчную кислоту, которая, помимо многих других применений, используется в качестве мягкого детергента для мембранных белков.Он повышает эффективность, с которой трипсин расщепляет цитозольные и мембранные белки, и легко удаляется за счет подкисления и фазового переноса (ФП) в несмешивающийся с пептидами этилацетат (ЭА) при жидкостно-жидкостной экстракции (1,6–11). PT уменьшает растворимые в EA загрязнители, включая SDS, n -октилглюкозид, NP-40 и Triton X-100 (12).

В протоколе eFASP опционально используется поверхностно-активное вещество TWEEN ® -20 для пассивации поверхностей фильтров Microcon ® и пробирок для сбора.TWEEN ® -20, а также SDS являются общепризнанными средствами для сведения к минимуму связывания белков с поверхностями и рекомендованы Amicon Centricon для использования в фильтрах (13). Пассивация фильтрующих элементов и пробирок для сбора, используемых в eFASP, может уменьшить потерю пептидов и белков из-за неспецифического поверхностного связывания, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить загрязнение масс-спектров ионами, связанными с TWEEN ® .

Здесь представлен подход eFASP, в котором используется 0,2% DCA и (необязательно) TWEEN ® -20 для количественного увеличения извлечения и протеомного покрытия гидрофильных и гидрофобных белков.Также включен вариант экспресс-метода eFASP, который использует одностадийное восстановление/алкилирование с использованием трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) и 4-винилпиридина (4-VP) перед осаждением на фильтре Microcon ® , повышая специфичность алкилирования и ускорение обработки (1,14–17).

3. Методы

Описаны два протокола eFASP. Первый — это стандартная процедура, в которой используется алкилирование на фильтре йодацетамидом ( см. ). Подзаголовок 3.1). Вторая представляет собой экспресс-процедуру, в которой используется алкилирование в растворе 4-винилпиридином, исключая некоторые этапы замены буфера для увеличения скорости ( см. ). Подзаголовок 3.2).

Выполняйте все процедуры при комнатной температуре или в соответствии с указаниями и соблюдайте инструкции по безопасности инструментов и химических веществ. Этапы пассивации можно пропустить, чтобы сэкономить время или если фоновые ионы, связанные с TWEEN ® , не могут быть сведены к минимуму в масс-спектрах.

3.1. eFASP: стандарт

3.1.1. Пассивация поверхности (дополнительно)
  1. На шейкере инкубируйте блоки фильтров и пробирки для сбора в течение ночи в растворе для пассивации. Небольшие партии образцов можно инкубировать в центрифужных пробирках Falcon объемом 50 мл.

  2. Чистым пинцетом извлеките каждый предмет и промойте его внешнюю и внутреннюю поверхности раствором MS-grade H 2 O, выдаваемым из пластиковой бутылочки.

  3. Перенесите предметы в чистую мензурку, содержащую большой объем MS-класса H 2 O; напр. , 250 мл или больше. Инкубируйте предметы в течение 30 минут при комнатной температуре, встряхивая на низкой скорости.

  4. повторите шаг 3 еще два раза со свежими образцами класса MS H 2 O.

  5. Сохраните пассивированные пробирки для сбора пептидов для извлечения пептидов из устройств ультрафильтрации.

3.1.2. Образец Лизис
  1. Промыть и осадить клетки в соответствии с установленными рекомендациями для типа клеток.

  2. Добавьте достаточное количество лизирующего буфера к осажденным клеткам таким образом, чтобы аликвота 25 мкл лизата обеспечивала необходимое количество для обработки с помощью eFASP (или максимальная концентрация белка 10 мкг/мкл). Убедитесь, что выбранный объем и размер трубки могут вместить ультразвуковой зонд.

  3. Поместите лизат в термосмеситель при 90°C и инкубируйте в течение 10 мин, встряхивая при 600 об/мин.Удалите лизат и уменьшите температуру термомиксера до 37°C для последующего использования.

  4. Обработайте лизат ультразвуком (используя ультразвуковой/гомогенизационный зонд) три раза по 10 секунд каждый.

  5. Центрифугировать лизат при 14 000 g в течение 10 мин.

  6. Повторите обработку ультразвуком и центрифугирование один раз (шаги 4 и 5).

  7. Обработайте лизат ультразвуком (включая любой гранулированный материал) в течение 10 сек. Остудить до 37°С.

3.1.3. Обработка проб
  1. Перенесите 25 мкл лизата в пробирку для проб, содержащую 200 мкл обменного буфера.Vortex кратко перемешать.

  2. Поместите фильтр (пассивированный) поверх непассивированной пробирки для сбора.

  3. Внесите 225 мкл образца лизата/обменного буфера в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин. Выбросьте фильтрат.

  4. Добавьте 200 мкл обменного буфера в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин. Выбросьте фильтрат.

  5. Повторите шаг 4 еще два раза.

  6. Внесите 100 мкл алкилирующего буфера в блок фильтров и перенесите его в термосмеситель при 37°C на 1 час, встряхивая при 300 об/мин.

  7. Отцентрифугируйте блок фильтров при 14 000 g в течение 10 минут. Выбросьте фильтрат.

  8. Добавьте 200 мкл обменного буфера в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин. Выбросьте фильтрат.

  9. Добавьте 200 мкл буфера для расщепления eFASP в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин. Выбросьте фильтрат.

  10. Повторите шаг 9 еще два раза.

  11. Перенесите блок фильтра в пассивированную пробирку для сбора.

  12. Добавьте 100 мкл буфера для расщепления eFASP в блок фильтра.

  13. Рассчитайте объем трипсинового буфера, который необходимо дозировать для достижения желаемого соотношения фермента и субстрата; напр. , 1:50 вес:ш.

  14. Поместите рассчитанный объем трипсинового буфера в блок фильтров и поместите в термосмеситель при 37°C на 12 часов, встряхивая на низкой скорости. Закрепите крышку блока фильтра, чтобы свести к минимуму испарение.

  15. Выньте блок фильтра/сборную трубку из термомиксера и отцентрифугируйте при 14 000 g в течение 10 мин. Сохранение фильтрата, содержащего пептиды .

  16. Внесите 50 мкл буфера для извлечения пептидов на блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин.

  17. Повторите шаг 16 один раз. Удерживают фильтрат, содержащий пептиды.

3.1.4. Phase Transfer
  1. В пробирку для сбора с пептидсодержащим фильтратом добавить 200 мкл этилацетата и перенести в пробирку Eppendorf LoBind ® объемом 2 мл.

  2. Добавьте 2,5 мкл ТФУ и быстро вортексируйте. Белый нитевидный осадок может быть виден, если присутствует большое количество пептида.

  3. Добавьте этилацетат почти до заполнения пробирки, оставив достаточно места только для перемешивания без потери жидкости.

  4. Перемешайте смесь в течение 10 секунд в ультразвуковой ванне и отцентрифугируйте при 16 000 × g в течение 10 минут.

  5. Осторожно перенесите пипеткой большую часть верхнего (органического) слоя в пробирку для утилизации.Не нарушайте органический/водный пограничный слой.

  6. Повторите шаги с 3 по 5 два раза.

  7. Поместите открытую пробирку с образцом в термосмеситель при 60°C в вытяжном шкафу на 5 минут для удаления остаточного этилацетата.

  8. Удаление остатков органических растворителей и летучих солей путем вакуумной сушки в SpeedVac ® .

  9. Ресуспендируйте высушенный образец в 50% метаноле и высушите в вакууме.

  10. Повторите шаг 9 два раза.

3.2. Экспресс eFASP

3.2.1. Поверхностная пассивация (
Дополнительно )
3.2.2. Образец Лизис
  1. Промыть и осадить клетки в соответствии с установленными рекомендациями для типа клеток.

  2. Добавьте достаточное количество лизирующего буфера к осажденным клеткам таким образом, чтобы аликвота 25 мкл лизата обеспечивала необходимое количество для обработки с помощью eFASP (или максимальная концентрация белка 10 мкг/мкл). Убедитесь, что выбранный объем и размер трубки могут вместить ультразвуковой зонд.

  3. Поместите лизат в термосмеситель при 90°C и инкубируйте в течение 10 мин, встряхивая при 600 об/мин. Удалите лизат и уменьшите температуру термомиксера до 37°C для последующего использования.

  4. Обработайте лизат ультразвуком (используя ультразвуковой/гомогенизационный зонд) три раза по 10 секунд каждый.

  5. Центрифугировать лизат при 14 000 g в течение 10 мин.

  6. Повторите обработку ультразвуком и центрифугирование один раз (шаги 4 и 5).

  7. Обработайте лизат ультразвуком (включая любой гранулированный материал) в течение 10 сек.Остудить до 37°С.

  8. Добавьте алкилирующий раствор к лизату до конечной концентрации 25 мМ 4-VP и поместите пробирку с образцом в термосмеситель при 37°C на 1 час при 300 об/мин.

  9. Добавьте в лизат буфер для гашения до конечной концентрации 40 мМ DTT.

3.2.3. Обработка проб
  1. Перенесите 25 мкл лизата в пробирку для проб, содержащую 200 мкл обменного буфера. Vortex кратко перемешать.

  2. Поместите фильтр (пассивированный) поверх непассивированной пробирки для сбора.

  3. Внесите 225 мкл образца лизата/обменного буфера в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин. Выбросьте фильтрат.

  4. Добавьте 200 мкл буфера для расщепления eFASP в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин. Выбросьте фильтрат.

  5. Повторите шаг 4 еще два раза.

  6. Отсоедините блок фильтра от непассивированной пробирки и поместите его поверх пассивированной пробирки.

  7. Добавьте 100 мкл буфера для расщепления eFASP в блок фильтра.

  8. Рассчитайте объем трипсинового буфера, который необходимо дозировать для достижения желаемого соотношения фермента и субстрата; напр. , 1:50 вес:ш.

  9. Поместите рассчитанный объем трипсинового буфера в фильтрующий блок и переместите узел фильтра/трубки для сбора в термосмеситель при 37°C на 12 ч встряхивания на низкой скорости. Закройте блок фильтра крышкой, чтобы уменьшить испарение.

  10. Выньте фильтр/трубку для сбора из термомиксера и отцентрифугируйте при 14 000 g в течение 10 мин. Сохраните фильтрат, содержащий пептиды.

  11. Внесите 50 мкл буфера для восстановления пептидов в блок фильтров и отцентрифугируйте при 14 000 × g в течение 10 мин.

  12. Повторите шаг 11 один раз.

Сноски

1. В этом протоколе используется дезоксихолевая кислота, а не дезоксихолат натрия, чтобы свести к минимуму воздействие натрия на аналит, который может ухудшить результаты масс-спектрометрического анализа. Даже с помощью жидкостной хроматографии в реальном времени для удаления большей части Na + кислые пептиды могут оказаться связанными с натрием.Недостатком замены дезоксихолата натрия дезоксихолевой кислотой является низкая растворимость первого; 0,2% DCA — это максимальная растворимость, достижимая в буфере ABC. Растворение дезоксихолевой кислоты в небольшом объеме этанола перед смешиванием с буфером может облегчить растворение. В качестве альтернативы буфер ABC можно добавить к соответствующему количеству твердой DCA непосредственно перед использованием и интенсивно встряхнуть; даже если он слегка мутный, свежеприготовленный раствор DCA можно использовать в eFASP. Растворы DCA не следует хранить в холодильнике; могут возникнуть необратимые осадки.Мы обнаружили, что 0,1% DCA работает почти так же хорошо, как 0,2% в eFASP; таким образом, проблемы с растворимостью можно облегчить, используя более низкую концентрацию. Наконец, дезоксихолат натрия может заменить дезоксихолевую кислоту с очисткой наконечника STAGE перед введением в колонку ЖХ.

2. В качестве альтернативы буфер для лизиса может содержать 5 мМ TCEP и/или буфер для алкилирования может быть составлен с 5 мМ йодацетамида.

3. Мы предполагаем, что концентрация чистого 4-винилпиридина составляет 8,8 М.

Модифицированный протокол FASP для высокопроизводительной подготовки образцов белков для масс-спектрометрии

Abstract

Для облегчения высокопроизводительного протеомного анализа мы разработали модифицированный протокол FASP, который повышает скорость обработки белковых образцов перед масс-спектрометрией. Адаптация исходного протокола FASP к 96-луночному формату требует увеличения времени вращения для замены буфера из-за низких скоростей центрифугирования, допускаемых этими устройствами.Однако, используя 96-луночные планшеты с более надежной полиэфирсульфоновой мембраной, отсекающей молекулярную массу, вместо целлюлозных мембран, обычно используемых в этих устройствах, мы могли бы использовать изопропанол в качестве смачивающего агента, уменьшая время отжима, необходимое для замены буфера, с часа до 30. минут. В типичном рабочем процессе, используемом в нашей лаборатории, это соответствует сокращению времени на 3 часа на одну чашку, обеспечивая время обработки, аналогичное FASP, для обработки до 96 образцов на чашку. Чтобы проверить, дал ли наш модифицированный протокол результаты, аналогичные FASP и другим FASP-подобным протоколам, мы сравнили производительность нашего модифицированного протокола с исходным FASP и недавно описанным eFASP и MStern-blot.Мы показываем, что все FASP-подобные методы, включая наш модифицированный протокол, демонстрируют одинаковую производительность с точки зрения идентифицированных белков и воспроизводимости. Наши результаты показывают, что наш модифицированный протокол FASP является эффективным методом высокопроизводительной обработки образцов белка для масс-спектрального анализа.

Образец цитирования: Potriquet J, Laohaviroj M, Bethony JM, Mulvenna J (2017) Модифицированный протокол FASP для высокопроизводительной подготовки образцов белков для масс-спектрометрии.ПЛОС ОДИН 12(7): e0175967. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175967

Редактор: Джон М. Джейкобс, Тихоокеанская северо-западная национальная лаборатория, США

Поступила в редакцию: 8 ноября 2016 г.; Принято: 3 апреля 2017 г .; Опубликовано: 27 июля 2017 г.

Авторские права: © 2017 Potriquet et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Данные доступны в MassIVE (https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/massive.jsp) под номером доступа MSV000080595.

Финансирование: Это исследование было поддержано наградой R01CA155297 от Национального института рака, наградой P50AI098639 от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и стипендиальной поддержкой (JPM) и поддержкой исследований (номер гранта 1051627) от Национального здравоохранения и медицины. Исследовательский совет Австралии.JM поддерживается стипендией для развития карьеры Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии (NHMRC). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Подготовка проб с фильтрацией (FASP) представляет собой метод эффективного получения триптических пептидов из сложных белковых смесей перед масс-спектральным анализом.FASP сочетает в себе использование мембраны с отсечением по молекулярной массе (MWCO) в качестве «реактора» [1], на котором сложные белковые смеси могут быть химически модифицированы и переварены, с использованием специализированных буферов, содержащих концентрированную мочевину, для эффективного удаления детергенты и избыток реагентов, участвующих в химической модификации белковых смесей [2, 3]. FASP представляет собой эффективный, удобный и действенный метод обработки клеточных или тканевых лизатов, содержащих детергенты [4], и стал широко применяться в протеомных рабочих процессах [5, 6].

Несмотря на то, что это разумное решение для подготовки образцов белка для масс-спектрометрии, исходная методология FASP использовала отдельные устройства для ультрафильтрации, такие как Microcon (Millipore) или Vivacon (Sartorius-Stedim), которые устойчивы к достаточно высоким скоростям центрифугирования. Однако для высокопроизводительной обработки многих образцов белков использование целлюлозных фильтров MWCO, используемых в протоколах FASP, в формате 96-луночных планшетов проблематично из-за низких скоростей центрифугирования, допускаемых этими устройствами.Затем центрифугирование между этапами промывки становится непомерно долгим, резко увеличивая время, необходимое для обработки образцов [7, 8]. Чтобы облегчить высокопроизводительный анализ клинических образцов, мы разработали метод, в котором используется протокол, подобный FASP, на 96-луночных планшетах с использованием более прочной полиэфирсульфоновой (ПЭС) фильтрующей мембраны вместо целлюлозного фильтра, обычно используемого в протоколах FASP. Пластины PES ранее использовались при разработке высокопроизводительных методов подготовки протеомных образцов [9], но эти протоколы также страдали необходимостью увеличения времени вращения для облегчения полной замены буфера.Используя мембрану PES в сочетании с изопропиловым спиртом в качестве смачивающего агента, наш усовершенствованный протокол обеспечивает 96-луночный метод FASP, который значительно сокращает время, необходимое для высокопроизводительной обработки образцов белка.

Со времени первоначального описания FASP в 2009 г. [10] было предложено несколько модифицированных протоколов для повышения производительности: улучшенный FASP (eFASP) предварительно пассивирует поверхности фильтров Microcon с 5% TWEEN-20 для повышения извлечения пептидов и использует поверхностно-активное вещество. (0.2% дезоксихолевой) на стадиях детергента и пищеварения для повышения эффективности трипсина [11]; 96-луночные планшеты с мембраной 10 MWCO использовались для обеспечения экономичной высокопроизводительной обработки мочи и клеточных линий человека [7, 8]; и, совсем недавно, MStern-blot (MStern) [12] использует крупнопористую гидрофобную поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану. Чтобы оценить относительную эффективность нашего протокола по сравнению с другими методами, подобными FASP, и оценить любое потенциальное воздействие на белки, выявленные в последующей масс-спектрометрии, мы сравнили эффективность нашего модифицированного протокола с другими методами, подобными FASP, FASP, eFASP и MStern-blot в протеомном анализе сложной белковой смеси из клеточных линий человека.

Материалы и методы

Для всех методов применялся один и тот же протокол лизиса и солюбилизации белка. Удаление восстановителей и алкилирующих агентов выполняли на фильтрующих устройствах, как описано в соответствующих протоколах для каждой методики. Все использованные пробирки и контейнеры с растворителем промывали 50% метанолом и сушили, чтобы свести к минимуму потенциальное загрязнение полиэтиленгликолем.

Лизис и солюбилизация белков нормальных клеток холангиоцитов человека H69

Клетки человека

Adherent H69 собирали с помощью 5-минутной инкубации с экспресс-раствором TrypLE (Gibco) при 37 °C с последующими тремя промывками с помощью PBS Dulbecco (Gibco) с центрифугированием при 800 × g в течение 5 минут между каждой промывкой.Приблизительно 6 миллионов клеток лизировали на льду путем ресуспендирования клеточного осадка в 250 мкл л 1% SDS, 5 мМ MgCl 2 , 10 мМ CHAPS и 100 мМ бикарбоната триэтиламмония (TEAB) с добавлением 1 × Roche Complete ингибиторов протеазы. . Сразу после лизиса ДНК и РНК разрушали добавлением 50 мМ Трис, 20 мМ NaCl и 2 мМ MgCl 2 с 10 мкл мкл 1 ед./ мкл мкл сверхчистой бензоназы (Sigma) с последующей инкубацией при 4°С в течение 30 минут при постоянном перемешивании.Концентрацию белка определяли с помощью анализа BCA (Pierce) в соответствии с протоколом производителя. Аликвоты по 50 мкл г белков в 10 мкл л буфера для лизиса переносили в отдельные микропробирки объемом 1,7 мл (Axygen) в количестве, достаточном для выполнения трех повторов каждого метода обработки образцов.

Модифицированный протокол FASP (10 и 30 кДа)

Количество белков в лизирующем буфере восстанавливали путем добавления 0,5 М исходного раствора ДТТ до конечной концентрации 20 мМ с последующей инкубацией при 95°C в течение 5 минут и охлаждением при комнатной температуре (кт) в течение 10 минут.Затем белки алкилировали в 40 мМ ИУК в течение 45 мин в темноте при комнатной температуре. Затем к образцу белка добавляли восемь объемов 8 М мочевины, 10% изопропанола в 100 мМ TEAB. Фильтровальные планшеты с отсечкой по молекулярной массе 10 или 30 кДа (96-луночные фильтровальные планшеты AcroPrep advance Omega, PALL), соединенные с планшетами с глубоким U-образным дном (Axygen) для сбора, готовили путем кратковременного центрифугирования 200 мкл л 60% изопропанола через фильтр при 3100×g. Затем образец белка переносили на планшет и центрифугировали при 3100×g в течение 30 мин в центрифуге 5810R (Eppendorf) с адаптированным бакетом для планшетов.Удаление детергента путем замены буфера выполняли двумя последовательными промывками 8 М мочевиной, 10% изопропанолом в 100 мМ TEAB с центрифугированием при 3100 × g в течение 30 мин между каждой промывкой. Затем мочевину удаляли двумя промывками 10% изопропанолом в 50 мМ TEAB с центрифугированием при 3100×g в течение 30 минут между каждой промывкой. Финальную промывку 50 мМ TEAB проводили с центрифугированием, как описано выше. Затем проводили расщепление белков, добавляя в лунки 1 мкг г трипсина в 50 мМ ТЭАВ и инкубируя в течение ночи при 37°.Пептиды извлекали, используя начальное вращение 3100 × g в течение 10 минут с последующим двумя центрифугированиями с 50 мкл л 50 мМ TEAB. Восстановленные пептиды сушили в скоростном вакууме в течение 4 часов при 45°С.

ФАСП

FASP выполняли, как описано ранее [2] с небольшими изменениями. Вкратце, белки восстанавливали и алкилировали, как описано выше, а затем смешивали с восемью объемами 8М мочевины в 100 мМ трис-HCl, рН 8. Единицы Microcon Ultracel 30 кДа (Millipore) готовили путем кратковременного центрифугирования 60% метанола через фильтр при 14 000 × г.Образцы белка переносили в фильтрующие блоки и центрифугировали при 14 000×g в течение 15 мин. Удаление детергента путем замены буфера выполняли двумя последовательными промывками 8 М мочевиной в 100 мМ трис-HCl, рН 8, с 15-минутным отжимом при 14000 g. В отличие от исходного протокола, для удаления избытка мочевины были включены три дополнительные промывки с использованием 100 мМ Tris-HCl, pH 8, с 15-минутным вращением при 14 000 × g между каждой промывкой. Расщепление белка достигали добавлением 1 мкг г трипсина в 50 мМ бикарбоната аммония (АВС) и инкубированием при 37°С в течение ночи.Пептиды были извлечены в результате двух промывок 50 мкл л 50 мМ ABC с вращением при 14000 × g в течение 5 минут каждая. Затем смесь сушили в вакууме в течение 4 часов при 45°С.

eFASP

eFASP выполняли, как описано ранее [11] с небольшими изменениями. Вкратце, за день до эксперимента фильтрующую установку Microcon Ultracel 30 кДа (Millipore) «пассивировали» путем инкубации в течение ночи в растворе сверхчистой воды с 5% об./об. TWEEN-20. Затем белки в лизирующем буфере восстанавливали и алкилировали, как описано выше, и смешивали с восемью объемами 8 М мочевины, 0.2% дезоксихолевая кислота (ДХК) в 100 мМ Tris-HCl pH 8. Пассивированные фильтрующие элементы тщательно промывали тремя погружениями в большом объеме сверхчистой воды и переносили на них белковые смеси перед вращением при 14000×g в течение 15 мин. Удаление детергента путем замены буфера выполняли с помощью двух последовательных промывок 8 М мочевиной, 0,2% DCA в 100 мМ трис-HCl, pH 8, с центрифугированием при 14 000 × g в течение 15 минут после каждой промывки. Затем мочевину удаляли тремя промывками 50 мМ ABC с 0,2% DCA с вращением при 14000×g в течение 15 мин.Расщепление белков осуществляли добавлением 1 мкг г трипсина в 50 мМ ABC с 0,2% DCA и инкубированием при 37°C в течение ночи. Пептиды были извлечены в результате двух промывок 50 мкл л 50 мМ ABC с вращением при 14 000 × g в течение 5 мин. Затем пептиды лиофилизировали перед масс-спектральным анализом.

МСШтерн-блот

MStern-Blot выполняли, как описано ранее [12] с небольшими изменениями. Вкратце, белки восстанавливали и алкилировали, как описано выше, и смешивали с восемью объемами 8 М мочевины в 100 мМ ABC.Лунки планшета размером 0,45 мк м с гидрофобной мембраной с высоким содержанием белка (PVDF) (Millipore) готовили пропусканием 70% этанола через фильтр на вакуумном коллекторе поверх глубокого собирающего планшета с U-образным дном. . Мембрану PVDF уравновешивали 8 М мочевиной в 100 мМ растворе ABC перед нанесением белковой смеси в лунки планшета фильтра. Белковую смесь трижды пропускали через мембрану, собирая поток и повторно нанося его на мембрану фильтра.В отличие от исходного протокола, перед двумя промывками с 50 мМ ABC использовали дополнительную промывку с использованием 8 М мочевины в 50 мМ ABC. Расщепление белков проводили, добавляя 1 мкг г трипсина в 50 мМ АВС и инкубируя при 37°С в течение ночи. Пептиды выделяли в планшете для сбора лунок с V-образным дном с использованием двух промывок 40% ацетонитрила (ACN), 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в воде MS-класса и лиофилизировали перед масс-спектральным анализом.

Тандемная масс-спектрометрия

триптических пептида солюбилизировали в растворе 0.1% TFA и обессоленный на наконечниках для пипеток ZipTip C18 (Millipore). Обессоленные пептиды лиофилизировали и ресуспендировали в 30 мкл л 0,1% муравьиной кислоты [водн.], 2% ацетонитрила и центрифугировали при 12000×g в течение 5 мин для удаления твердых частиц. Пептиды разделяли хроматографически на приборе Eksigent Ekspert nanoLC 415 (AB SCIEX). Сначала 2 мкл мкл обессоленных пептидов (примерно 2 мк г пептида) вводили в колонку-ловушку ChromXP C18CL (3 мк м, 120 Å, 10×0.3 мм) при 5 мкм л/мин в течение пяти минут в 0,1% муравьиной кислоте [водн.]/5% ACN (растворитель А) перед помещением в линию с ChromXP C18 (3 мкм м, 120 Å, 15 см x 75 мкм м) колонка nanoLC. Пептиды элюировали тремя последовательными линейными градиентами: 5–10 % растворителя B (ACN/0,1 % муравьиной кислоты) в течение 2 мин, 10–40 % растворителя B в течение 58 мин и 40–50 % растворителя B в течение 5 мин при объеме 300 нл. /мин расход. Элюированные пептиды пропускали непосредственно в ионный источник наноэлектрораспыления масс-спектрометра TripleTOF 5600+ (AB SCIEX) для тандемной масс-спектрометрии со следующими параметрами: напряжение ионного распыления устанавливали на 2300 В, потенциал декластеризации 150 В, поток газовой завесы 25 , распыляющий газ 1 (GS1) 15 и нагреватель интерфейса при 150°C.Данные полного сканирования TOF-MS были получены в режиме информационно-зависимого сбора данных (IDA) в диапазоне масс 350–1350 (m/z) со временем накопления 250 мс и для ионов-продуктов 100–2000 (m/z) со временем накопления 50 мс. время накопления всего 10 606 циклов. Ионы, наблюдаемые при сканировании TOF-MS, превышающие пороговое значение в 150 отсчетов и имеющие зарядовое состояние от +2 до +5, были настроены так, чтобы инициировать получение спектров ионов-продуктов максимум для 40 наиболее интенсивных ионов. Динамическое исключение было включено на 10 секунд после одного появления иона-предшественника.Масс-спектрометр автоматически повторно калибровался с помощью расщепления B-галактозидазы после каждых 2 образцов. Данные были получены и обработаны с использованием программного обеспечения Analyst TF 1.7 (AB SCIEX). Спектральные данные, полученные в ходе исследования, находятся в открытом доступе на сайте MassIVE (https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/massive.jsp) под инвентарным номером MSV000080595 по лицензии CC-BY 4.0.

Поиск в базе данных

Спектральный поиск обработанных данных ЖХ-МС/МС был выполнен с использованием ProteinPilot v4.5 (AB SCIEX) с использованием алгоритма Paragon (версия 4.5.0.0) со следующими параметрами: допускается один пропуск расщепления, в качестве фиксированной модификации указано карбоксиметилирование, а в качестве переменной модификации указано окисление метиона, в качестве специального коэффициента также задана денатурация мочевины. . Использовалась коррекция фона и биологические модификации, указанные в качестве фокуса ID. Порог обнаруженного белка был установлен равным 0,5, а коэффициент ложного обнаружения (FDR) был рассчитан с использованием поиска в базе данных-приманке, состоящей из обратных последовательностей.Поиск проводился по эталонному набору протеомов человека SwissProt, содержащему 70236 белковых последовательностей (загружен 30 марта 2016 г.).

Результаты и обсуждение

Полиэфирсульфон в качестве мембраны для анализа FASP

Обработка образцов тканей в 96-луночных планшетах — это удобный и высокопроизводительный метод обработки большого количества образцов перед масс-спектрометрией, особенно для клинических применений. Однако использование FASP в 96-луночных планшетах, оснащенных целлюлозными мембранами MWCO, обычно требует времени центрифугирования в течение часа или более при 3200×g для эффективной замены буфера на этапах промывки [7, 8, 12].Мы модифицировали стандартный протокол FASP для использования более надежной фильтрующей мембраны PES, а затем смогли ввести 10 % изопропанола в наш рабочий процесс в качестве смачивающего агента (рис. S1), что привело к сокращению примерно на 50 % времени, необходимого для достижения полного замена буфера при 3200×g. Благодаря не менее чем семи этапам замены буфера в нашем рабочем процессе (рис. S1) это привело к сокращению времени подготовки образца на 3 часа. Способность изопропанола улучшать скорость буферного обмена, вероятно, связана со снижением поверхностного натяжения между водным слоем и мембраной [13], и хотя спирт может снижать критические концентрации мицеллообразования (ККМ) детергентов [14], воздействуя как на удаление детергента при замене буфера и его способность солюбилизировать белки, вероятно, уравновешивается положительным влиянием мочевины на ККМ [15].Используя этот модифицированный протокол, мы успешно обработали образцы белков из самых разных источников, включая клеточные линии, желчные экстракты, ткани человека и препараты экзосом.

Белки, идентифицированные с использованием различных методов обработки

PES 96-луночные планшеты доступны с мембранами MWCO 10 и 30 кДа, и для сравнения эффективности нашего модифицированного протокола с другими протоколами, подобными FASP, мы использовали каждый метод, FASP, eFASP, MStern и версии 30 и 10 кДа. нашего метода (обозначаемого ниже как pFASP-30 и -10), для обработки общего белка из линии раковых клеток (KKU055) перед тандемным масс-спектральным анализом на масс-спектрометре AB SCIEX 5600+.На рис. 1 суммировано количество и характеристики белков, идентифицированных с использованием различных методов. Модифицированный протокол обеспечил сравнимое количество идентификаций белков с другими FASP-подобными методами; идентифицированные белки варьировались от 741 для eFASP до 644 для MStern (рис. 1A), где pFASP-10 и -30 обеспечивают 675 и 722 соответственно. Каждый метод показал одинаковую воспроизводимость, измеренную количеством уникальных идентификаций белка в каждой повторности; MStern обеспечивает наиболее воспроизводимый набор идентификаций белков (11%), а pFASP-10 — наименьший (14%; рис. 1B).

Рис. 1. Идентификация общего белка с использованием различных методов обработки.

A. Сравнение гистограммы среднего количества неизбыточных белков, идентифицированных в трех повторностях каждого метода подготовки образцов; B. Сравнение столбчатой ​​диаграммы среднего количества уникальных белков, идентифицированных в каждой повторности каждого метода; C. Средний процент от общего количества терминов GO «клеточный компонент», возвращенных белками, идентифицированными в каждой повторности каждого метода, которые были связаны с цитозольным, мембранным или ядерным субклеточным расположением; Д. Графики плотности показателей GRAVY для белков, идентифицированных с использованием каждого метода обработки белков; E. Средняя масса белков, идентифицированная в каждой повторности каждого метода процессинга белков; и F. Радарная диаграмма, показывающая отдельные характеристики белков и пептидов, идентифицированных с использованием каждого метода обработки белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175967.g001

Клеточное расположение и гидрофобность идентифицированных белков

Чтобы определить, существуют ли различия в характеристиках белков, идентифицированных с использованием разных методов FASP, сравнивали клеточную локализацию, гидрофобность и размер идентифицированных белков.Сравнение терминов GO «клеточный компонент», связанных с идентифицированными белками, позволяет предположить, что методы pFASP идентифицировали чуть больше мембранных белков, чем другие методы (рис. 1C), хотя различия между каждым методом были незначительными, как сообщалось ранее при сравнении FASP. и eFASP [16]. Точно так же графики плотности белковых показателей GRAVY (мера гидропатии аминокислотных последовательностей [17]) были весьма схожими, хотя MStern действительно показал меньше идентификаций белка в гидрофильных областях графика (рис. 1D).Поскольку это единственный метод, основанный на гидрофобных взаимодействиях, а не на MWCO, для удержания белков на мембране, это может отражать тенденцию большего количества гидрофильных белков проходить через мембрану PVDF до завершения процессинга, как предполагалось ранее [12] и как отражено в меньшем количестве мембранных белков, идентифицированных с помощью этого метода (рис. 1C).

Уникальные идентификаторы, полученные различными методами

Чтобы определить, идентифицировал ли каждый метод похожий набор белков, идентификацию белков из всех повторов объединяли, а перекрывание идентификаций белков визуализировали с помощью графика Upset [18].Из 1669 идентифицированных белков только 403 были идентифицированы всеми методами (рис. 2А). Около 542 идентификаций белков, 32% от общего числа, были идентифицированы только одним из протестированных методов (выделены на рис. 2А). Хотя в этом анализе без предварительного фракционирования белков и относительно короткого хроматографического разделения перед МС-анализом это можно было бы объяснить стохастическими эффектами, показатели GRAVY и термины GO для клеточного местоположения для каждого метода сравнивались, чтобы определить, были ли какие-либо систематические эффекты, связанные с различными методами.Графики плотности баллов GRAVY для идентифицированных белков в каждом методе показывают, что метод MStern обеспечивает более уникальную идентификацию белков в более узком диапазоне гидрофобности, тогда как другие методы обеспечивают уникальную идентификацию как более гидрофильных, так и гидрофобных белков. Как обсуждалось, больше гидрофильных белков может не удерживаться на мембране PVDF, но также возможно, что некоторые гидрофобные пептиды могут не элюироваться с мембраны после обработки, о чем свидетельствуют более длинные правые хвосты методов MWCO в плотности баллов GRAVY. участок (рис. 2B).В сочетании с графиком плотности оценок GRAVY на рис. 1D кажется, что MStern обеспечивает более глубокое покрытие в меньшем диапазоне гидрофобности, в то время как методы MWCO обеспечивают идентификацию в более широком диапазоне гидрофобности за счет более мелкого покрытия (в этих экспериментальных условиях). ). Это также отражалось как в большем количестве связанных с мембраной терминов GO, обеспечиваемых уникальными идентификациями с помощью методов MWCO (рис. 2C), так и в дополнительных 136 идентификациях белков, не идентифицированных с использованием метода MStern (отмечены звездочками на рис. 2A).

Рис. 2. Анализ нарушений белков, идентифицированных с использованием каждого метода пробоподготовки, и характеристики уникальных белков, идентифицированных только с использованием одного метода.

A. Расстроенная диаграмма, показывающая перекрытие белков, идентифицированных с использованием каждого метода обработки белков. Количество идентифицированных белков, общих для разных наборов методов, указано на верхней гистограмме, а конкретные методы в каждом наборе обозначены сплошными точками под гистограммой. Общее количество идентификаций для каждого метода указано слева как «Идентификации по методу».Рисунок создан с помощью пакета Upset R [18]; B. Графики плотности показателей GRAVY для белков, однозначно идентифицированных в каждом методе обработки белков; и C. Средний процент от общего количества терминов GO «клеточный компонент», возвращенных белками, однозначно идентифицированными в каждой повторности каждого метода, которые были связаны с цитозольным, мембранным или ядерным субклеточным расположением.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175967.g002

Выводы

В этой работе мы показали, что наш модифицированный протокол FASP является полезной адаптацией протокола FASP для сокращения времени, необходимого для высокопроизводительного анализа большого количества образцов в 96-луночном формате.Используя наш метод, мы смогли сократить время отжима на 50%, что соответствует 3 часам в нашем типичном рабочем процессе подготовки образцов. По сравнению с другими FASP-подобными протоколами пробоподготовки наш метод обеспечивает производительность, аналогичную другим FASP-протоколам, с таким же количеством идентификаций белков и таким же уровнем воспроизводимости. В нашем модифицированном протоколе мы используем повышенную надежность мембран PES для использования изопропанола в качестве смачивающего агента, что позволяет ускорить замену буфера, но стойкость мембраны к ряду органических растворителей допускает другие потенциальные рабочие процессы с использованием этих растворителей, например обработка белков раствором фенола после выделения ДНК.Теперь мы использовали наш модифицированный метод для обработки белковых смесей из широкого круга биологических источников, и представленная здесь работа предполагает, что наш метод обеспечивает полезную технику для высокопроизводительной обработки образцов для протеомного анализа.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Краткое описание рабочего процесса подготовки проб для каждого метода обработки.

Время приготовления одного образца, включая 18 часов трипсинового расщепления и осаждение в течение ночи для препарата в растворе, указано в нижней части блок-схемы.Время приготовления показывает, что pFASP сравним с FASP-подобными методами, в которых используются центрифуги. Это позволяет быстро и с высокой пропускной способностью обрабатывать большое количество образцов в 96-луночных планшетах со временем обработки, аналогичным таковому в FASP-подобных методах с использованием отдельных блоков центрифугирования.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175967.s001

(PDF)

Благодарности

Это исследование было поддержано наградой R01CA155297 от Национального института рака, наградой P50AI098639 от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и стипендиальной поддержкой (JPM) и поддержкой исследований (номер гранта 1051627) от Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии.JM поддерживается стипендией для развития карьеры Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии (NHMRC). Данные, представленные в этой статье, были получены в Центральном аналитическом исследовательском центре Института окружающей среды будущего (QUT).

Каталожные номера

  1. 1. Манза Л.Л., Стамер С.Л., Хэм А.Дж., Кодряну С.Г., Либлер Д.К. Подготовка и расщепление образцов для протеомного анализа с использованием спиновых фильтров. Протеомика 2005;5(7):1742–1745. пмид:15761957
  2. 2.Wiśniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, Mann M. Универсальный метод подготовки образцов для анализа протеома. Нат Методы. 2009;6(5):359–62. пмид:19377485
  3. 3. Нагарадж Н., Лу А., Манн М., Вишневски Дж. Р. Метод на основе детергента, но без геля позволяет идентифицировать несколько сотен мембранных белков за один прогон ЖХ-МС. J Протеом Res. 2008;7(11):5028–5032. пмид:18839980
  4. 4. Качук С., Стивен К., Дусетт А. Сравнение методов истощения додецилсульфата натрия для анализа протеома с помощью масс-спектрометрии.Ж Хроматогр А. 2015;1418:158–166. пмид:26422304
  5. 5. Велберри Смит М.П., ​​Зоугман А., Кэрнс Д.А., Уилсон М., Винд Т., Вуд С.Л. и др. Сывороточная аминоацилаза-1 является новым биомаркером с потенциальной прогностической ценностью для долгосрочного исхода у пациентов с отсроченной функцией трансплантата после трансплантации почки. почки инт. 2013;84(6):1214–1225. пмид:23739232
  6. 6. Нагарадж Н., Вишневски Дж. Р., Гейгер Т., Кокс Дж., Кирхер М., Келсо Дж. и др. Глубокое картирование протеома и транскриптома линии раковых клеток человека.Мол Сист Биол. 2011;7:548. пмид:22068331
  7. 7. Yu Y, Suh MJ, Sikorski P, Kwon K, Nelson KE, Pieper R. Подготовка проб мочи в 96-луночных фильтровальных планшетах для количественной клинической протеомики. Анальная хим. 2014;86(11):5470–5477. пмид:24797144
  8. 8. Свитзар Л., Ван Ангерен Дж., Пинксе М., Кул Дж., Ниссен В.М. Высокопроизводительный метод подготовки образцов для клеточной протеомики с использованием 96-луночных фильтровальных планшетов. Протеомика. 2013;13(20):2980–2983. пмид:23943524
  9. 9.Арул А.Б., Бьямбадорж М., Хан Н.Ю., Парк Дж. М., Ли Х. Разработка автоматизированного высокопроизводительного протокола подготовки проб для протеомного анализа Bull Korean Chem Soc 36, Bull. Корейский хим. соц. 2015;36(7): 1791–1798.
  10. 10. Wiśniewski JR, Zielinska DF, Mann M. Сравнение установок ультрафильтрации для протеомного и N-гликопротеомного анализа методом подготовки проб с фильтрацией. Анальная биохимия. 2011;410(2):307–309. пмид:21144814
  11. 11. Эрде Дж., Лу Р.Р., Лу Дж.А.Enhanced FASP (eFASP) для увеличения охвата протеома и извлечения образцов для количественных протеомных экспериментов. J Протеом Res. 2014; 13(4):1885–1895. пмид:24552128
  12. 12. Бергер С.Т., Ахмед С., Мунтел Дж., Куэвас Поло Н., Бачур Р., Кенцис А. и др. MStern Blotting-Высокопроизводительная подготовка протеомных образцов на основе поливинилиденфторида (ПВДФ) для 96-луночных планшетов. Мол клеточная протеомика. 2015;14(10):2814–2823. пмид:26223766
  13. 13. Гахремани Х., Моради А., Торгабех-Абедини Дж., Хасани С.Измерение поверхностного натяжения бинарных смесей вода + спирты по дифрактограмме поверхностной ряби // Дер хим. Грех. 2011;6:212–221.
  14. 14. Сидим Т., Акар Г. Влияние спиртов на критическую концентрацию мицеллообразования в смешанных растворах полисорбата 20 и цетилтриметиламмонийброма. J Поверхностно-активные вещества детерг. 2013;16(4):601–607. пмид:23794797
  15. 15. Руис СС. Фотофизическое исследование влияния мочевины на мицеллярные свойства водных растворов додецилсульфата натрия.Коллоидная и полимерная наука. 1995;273(11):1033–1040.
  16. 16. Нел А.Дж., Эндрю Дж.М., Гарнетт С., Блэкберн Дж.М., Соарес Н.К. Сравнительная переоценка методов FASP и расширенного FASP с помощью ЖХ-МС/МС J Proteome Res. 2015;14(3):1637–1642. пмид:25619111
  17. 17. Кайт Дж., Дулитл РФ. Простой метод отображения гидропатического характера белка. Дж Мол Биол. 1982;157(1):105–132. пмид:7108955
  18. 18. Лекс А., Геленборг Н., Стробелт Х., Вюйлемо Р., Пфистер Х.UpSet: визуализация пересекающихся наборов. IEEE Trans Vis Comput Graphics. 2014;20(12):1983–1992.

Финская программа авиационной безопасности, план, целевые показатели и показатели

Финская программа авиационной безопасности FASP

Обновленная версия 7.0 Финской авиационной программы FASP была опубликована 10 декабря 2020 года. Финскую версию FASP 7.0 можно найти на сайте SSP/ Веб-страницы SPAS (FASP / FPAS) по этой ссылке (Внешняя ссылка).Английская версия была опубликована 20 января 2021 года, и ее можно найти на этой странице ниже. Также выполняется перевод на шведский язык.

Что такое FASP?

Финская программа безопасности полетов (FASP) — это описание нашей системы управления безопасностью полетов на национальном уровне. FASP состоит из четырех секторов, которые также включают восемь важнейших элементов ИКАО для обеспечения безопасности полетов, которые ИКАО требует от государств для эффективного управления. К этим секторам относятся:

  1. Политика, цели и ресурсы Финляндии в области обеспечения безопасности полетов
  2. Управление рисками для безопасности полетов
  3. Обеспечение безопасности полетов
  4. Повышение безопасности полетов

FASP имеет два приложения: Приложение 1, План обеспечения безопасности полетов Финляндии и Приложение 2, Авиация Финляндии цели безопасности, а также показатели и целевые показатели безопасности.FASP публикуется с 2012 года. Любая необходимость обновления FASP и приложений к нему рассматривается один раз в год.

Почему ФАСП?

Механизмы управления безопасностью включают системные методы, используемые для поддержания и повышения безопасности полетов на международном, национальном и организационном уровнях. Государственные программы безопасности (ГПБ), как и FASP в Финляндии, являются элементом управления безопасностью на национальном уровне. С помощью FASP и приложений к нему национальная безопасность полетов управляется скоординированным и систематическим образом, а национальная политика безопасности полетов внедряется в повседневную работу по обеспечению безопасности.

Обязанности, связанные с FASP и приложениями к нему

Обязательства по государственным программам и планам обеспечения безопасности вытекают из правил ЕС, Приложения 19 ИКАО и Закона об авиации Финляндии. Traficom несет ответственность за подготовку, принятие и обновление FASP и приложений к нему.

Эксплуатанты авиации и поставщики услуг несут ответственность за безопасность своих полетов. Они должны учитывать Финскую программу авиационной безопасности и приложения к ней в своей деятельности и контролировать достижение целей.

Закон о добросовестном взыскании долгов

В 1977 году Конгресс принял Закон о добросовестном взыскании долгов (FDCPA) как способ защиты потребителей от домогательств, обмана и недобросовестной тактики со стороны коллекторов. FDCPA применяется к личным и семейным долгам, полученным третьими лицами, что происходит, когда кредитор, которому вы должны, либо продает долг другой компании, либо нанимает другое лицо или компанию для взыскания долга с вас от их имени. Для вас важно понимать свои права в соответствии с FDCPA и знать, что делать, если коллектор нарушил ваши права.

Права потребителей в соответствии с Законом о добросовестной практике взыскания долгов

Конфиденциальность: Коллекторам не разрешается обсуждать ваш долг ни с кем, кроме вашего супруга, ваших родителей, если вы несовершеннолетний, и вашего адвоката, если у вас есть представитель, который вас представляет. Хотя сборщики долгов могут предоставлять информацию о долгах бюро кредитных историй, они не могут публиковать имена людей, у которых есть долги. Вся почта, которую вы получаете о долгах, должна быть в конвертах, на которых не указано, что они получены от коллекторов.Коллекторам разрешено связываться с другими людьми, чтобы узнать ваш адрес, номер домашнего телефона или место работы, но они не могут обсуждать ваш долг с этими людьми.

Проверка: Все сборщики долгов должны отправить вам уведомление о подтверждении в течение пяти дней после того, как они впервые свяжутся с вами, и в этом уведомлении должна быть указана сумма долга и имя первоначального кредитора. После того, как вы получите это уведомление о проверке, вы имеете право запросить подтверждение того, что долг принадлежит вам, но вы должны запросить это подтверждение в течение 30 дней.Если вы не запрашиваете проверку, это будет автоматическим подтверждением того, что задолженность действительна.

Ограничение связи: Коллекторам никогда не разрешается связываться с вами с 21:00 до 8:00, если вы не согласитесь связаться в это время. Если вы скажете им не связываться с вами на работе, они должны перестать с вами связываться на работе. Кроме того, им не разрешается беспокоить вас чрезмерными телефонными звонками. Как только вы сообщите им, что адвокат представляет вас в отношении этого долга, они должны общаться только с вашим адвокатом.

Завершение связи: В любое время вы можете потребовать, чтобы коллектор прекратил с вами все формы связи. Для этого вы должны отправить коллектору письмо с просьбой вообще не связываться с вами по поводу этого долга. Отправьте его заказным письмом с уведомлением о вручении, чтобы у вас было доказательство того, что коллектор получил письмо. После получения письма единственные причины, по которым коллектор может связаться с вами снова, — это подтвердить получение письма или сообщить вам, что они собираются предпринять определенные действия, например подать иск против вас.

Честность: Коллекторам никогда не разрешается предоставлять ложную, ложную или вводящую в заблуждение информацию при общении с вами. Они не могут выдавать себя за государственных чиновников или людей, которые работают в компаниях, которые первоначально одолжили вам деньги. Они не должны угрожать вам действиями, которые они не могут или не собираются предпринимать, такими как ваш арест, продажа вашей собственности или причинение физического вреда вам или вашей семье. Сборщикам долгов также не разрешается заявлять, что отправляемые ими документы являются законными судебными документами, если они таковыми не являются.

Что делать, если коллекторы нарушают ваши права потребителей

В соответствии с Законом о добросовестной практике взыскания долгов у вас есть несколько вариантов действий, которые вы можете предпринять, если сборщик долгов применяет нечестные методы или преследует вас. Если коллектор нарушает какое-либо из прав, изложенных выше, вы можете предпринять одно или несколько из трех возможных действий:

  1. Отправьте письмо о прекращении связи, чтобы положить конец всем формам преследования со стороны коллекторов. В этом письме укажите, что вы хотели бы, чтобы коллектор перестал связываться с вами любым способом, включая домашний телефон, мобильный телефон, рабочий телефон, текстовое сообщение, почту и лично.Как только коллектор получит это письмо, по закону он не сможет связаться с вами, за исключением подтверждения получения письма или информирования вас о конкретных действиях, которые они предпримут.
  2. Подайте жалобу в Генеральную прокуратуру вашего штата и Бюро финансовой защиты прав потребителей. В своей жалобе укажите, кто является коллектором, какие ваши права потребителя были нарушены и что коллектор сделал, что нарушило ваши права. Эти группы могут помочь решить проблемы от вашего имени, а также могут передать предоставленную вами информацию правоохранительным органам, которые могут предпринять прямые действия против коллектора.
  3. Подайте в суд на сборщиков долгов. Денежная компенсация может быть присуждена за потерянную заработную плату или медицинские счета, возникшие в результате поведения сборщика долгов, в дополнение к деньгам для покрытия ваших судебных издержек и гонораров адвоката и до 1000 долларов США наличными для возмещения общего ущерба. Если вы планируете подать иск, вам необходимо задокументировать конкретные способы нарушения ваших прав в соответствии с FDCPA. Сохраняйте копии всех писем, которые вы получили от коллектора и отправили коллектору.Кроме того, регистрируйте дату, время и содержание всех телефонных разговоров.

Как можно скорее Коллекторские услуги лохотрон?

Ответ: НЕТ .

Если ваш ответ да, вы можете поговорить с одним из наших консультантов! Мы обнаружили против них дела о нарушении Закона о справедливой практике взыскания долгов. Прежде чем платить этой компании, обязательно проверьте свои права потребителя. Свяжитесь с нами сегодня для бесплатной консультации, чтобы узнать свои права и не позволяйте A.S.A.P. Служба инкассации поможет вам!

А.С.А.П. В отношении Службы по взысканию долгов возбуждены следующие дела за нарушение Закона о справедливой практике взыскания долгов (FDCPA).

  • искажение характера, суммы или правового статуса предполагаемого
    долга
  • создание и использование ложных, вводящих в заблуждение и вводящих в заблуждение заявлений в попытке взыскать предполагаемый долг
  • пригрозили предпринять действия, которые не могут быть предприняты по закону или не предназначены для совершения

Если у вас был подобный опыт с А.С.А.П. Службы по сбору платежей, то у вас есть потенциальный иск против них. Ниже приведены образцы открытых дел против них за вышеуказанные нарушения FDCPA.

Название партии Номер дела Название дела
КАК МОЖНО СКОРЕЕ Услуги по сбору платежей 3:2016cv07041  Рид и др. против Дюри и др.
КАК МОЖНО СКОРЕЕ Услуги по сбору платежей 5:2014cv00981 Вутен против A.S.A.P. ООО «Коллекционные услуги»
А.С.А.П. Услуги по сбору платежей 5:2013cv00845 Adalumo против A.S.A.P. Collection Services, Inc и др.

КАК МОЖНО СКОРЕЕ Коллекторские услуги Профиль компании

КАК МОЖНО СКОРЕЕ Коллекторские услуги — это агентство по взысканию долгов по недвижимому имуществу. Они утверждают, что подпадают под действие Закона о справедливой практике взыскания долгов и Гражданского кодекса Калифорнии.

Адрес: 331 Piercy Road
Сан-Хосе, CA 95138

Номер телефона: (408) 363-9600
года в бизнесе: Неизвестно
. Зарегистрирована: неизвестно
Тип организации: сборщик ипотечных кредитов
Веб-сайт: http://www.asapcollect.com/
Ведение бизнеса как: A.S.A.P. Услуги по сбору платежей

Если у вас или у кого-либо из ваших знакомых была A.S.A.P. Служба по взысканию долгов или любое другое агентство по сбору платежей нарушают ваши права потребителя, подайте в суд на коллектора, чтобы помочь вам! Уделите немного времени, чтобы заполнить нашу бесплатную консультационную анкету   внизу этой страницы! Наша группа юристов-экспертов рассмотрит вашу информацию и поможет определить, есть ли у вас дело против коллектора… бесплатно для вас!

Если вы или кто-то из ваших знакомых сотрудничал с этой компанией или любым другим агентством по сбору платежей, вы нарушаете свои права потребителя, пусть вам поможет Sue the Collector!

Найдите минутку, чтобы заполнить наш Бесплатный Опрос Консультации в нижней части этой страницы! Наша экспертная юридическая команда рассмотрит вашу информацию и поможет вам определить, есть ли у вас дело против коллектора… бесплатно для вас!

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.